胡淑芳 杨丽 徐子辉

1武汉市汉口医院内分泌科（武汉 430012）；2华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院内分泌科，分子诊断湖北省重点实验室（武汉 430014）

2型糖尿病（type II diabetes，T2D）是以胰岛素抵抗和胰腺细胞功能丧失引起的糖脂代谢紊乱为重要病理特征的威胁人类健康的慢性代谢疾病［1］。流行病学调查发现，2013年全球约有3.82亿人口患有糖尿病，且以9.5%的增长率逐年递增，至2035年或可能达到5.92亿［8］。同时，占据90%糖尿病总数的2型糖尿病引起肾脏衰竭、肝损伤和神经元凋亡等多种严重疾病。研究［2-3］发现，肝脏、肌肉和脂肪等主要糖脂代谢组织的胰岛素敏感性降低和胰岛炎症细胞浸润是T2D血糖不受控制的主要因素。并且，目前临床针对T2D的治疗方式以罗格列酮（rosiglitazone，RG）等促胰岛素分泌和胰岛素增敏剂为主，然而，此类治疗方式易致低血糖和体重增加，并且餐后血糖难以控制［4］。因此，替代疗法和消渴药等天然化合物的对于2型糖尿病的治疗作用备受关注［5］。

双脱甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin，BDMC）是从传统中药姜黄（curcuma longa L）根茎中提取具有抗肿瘤、降脂等作用的天然化合物单体［6］。研究［7］证实，BDMC可以通过清除自由基和增强抗炎作用、激活过氧化物酶体增生物激活受 体-γ（peroxisome prolifterator⁃activated receptor gamma，PPAR⁃γ）等具有预防和改善T2D的作用。而AMPK信号通路以及G6Pase和PEPCK是机体调控糖自稳的重要信号分子，并且最新研究发现双脱甲氧基姜黄素具有调控AMPK信号通路作用。然而，BDMC对胰岛素抵抗和糖自稳等的作用目前尚未见报道。因此，本实验主要观察BDMC治疗后db/db糖尿病小鼠胰岛素抵抗和糖自稳的情况，为双脱甲氧基姜黄素在T2D的临床治疗提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂双脱甲氧基姜黄素和罗格列酮购置于美国Sigma公司，血糖仪使用美国Johnson公司One Touch Ultra，稳豪型血糖仪。小鼠血浆胰岛素ELISA检测试剂盒（Millipore，Billerica，MA，USA）。pAMPK，AMPK，pAS160（Thr172），AS160，PM⁃GLUT4，GLUT4，G6Pase，和PEPCK多克隆抗体购自于美国Abcam公司，β⁃actin单克隆抗体购自于武汉康为世纪公司，二抗购自于武汉Abclone公司。

1.2实验动物及分组本实验采用的db/db糖尿病小鼠购置于北京华阜康生物科技股份有限公司，并于武汉市汉口医院动物实验中心SPF级实验室饲养并进行实验。以C57BL/6为对照组（WT），选用4周龄的雄性db/db小鼠，体质量21～23 g之间，依照体重，均衡随机分3组，每组9只。db/db组以生理盐水灌胃，RG治疗组以RG 0.5 mg/（kg·d），BDMC治疗组以BDMC 15 mg/（kg·d）灌胃至6周。实验期间，自由饮食、饮水，于每周检测各组小鼠的随机血糖。第6周末置于代谢笼中监测其呼吸交换率和能量输出变化，行口服糖耐量试验（OGTT）。

1.3OGTT于第6周末将各组小鼠隔夜禁食12 h，依据体质量以0.5 g/kg给予葡萄糖灌胃口服，分别于0、30、60、90和120 min血糖及血浆胰岛素水平。

1.4外周血HbA1c检测采集空腹抗凝血，分离血清，采用酶法检测各组小鼠外周血糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）含量，检测仪器为BIO⁃RAD D10TM检测仪。

1.5外周血血脂含量检测采用酶法检测各组小鼠血浆中TC、TG、HDL⁃C、LDL⁃C和FFA含量。

1.6 HOMA⁃IR和QUICKI评估胰岛素抵抗的稳态指数（homeostatic index of insulin resistance，HOMA⁃IR）通过稳态模型评价，计算公式为：HOMA⁃IR=（空腹血糖值×空腹血胰岛素值）/22.51。定量胰岛素敏感性检测指数分析（quantita⁃tive insulin sensitivity check index，QUICKI）通过公式计算：QUICKI=1÷［Log（空腹血胰岛素值）+Log（空腹血糖值）］。

1.7Western blot检测实验结束后处死小鼠，取出肝脏和骨骼肌肉组织、以PBS洗去血渍，称取100 mg加入200 μL含cocktail和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰水浴剪碎后超声破碎，冷却并冰上裂解10 min，12 000 g离心20 min取上清至新Ep管中，采用考马斯亮蓝G250法检测浓度后，取出200 μL并调节蛋白浓度至5 μg/L。随即，检测肝脏G6Pase、PEPCK和骨骼肌p⁃AMPK、AMPK、PM⁃GLUT4、GLUT4、pAS160、AS160蛋白表达水平。加入含BE的5×loading buffer并95℃干热变性10 min，冰上冷却后以100 μg总蛋白，10%SDS⁃PAGE分离胶电泳分离，200 mA恒流湿转至PVDF膜上，5%BSA的TBST溶液室温封闭1 h，加入一抗后4℃摇床孵育8 h，第二天TBST室温漂洗四次，每次5 min。孵育二抗TBST溶液（以1∶10 000稀释）室温2 h，TBST室温漂洗4次，每次5 min。ECL发光显示。蛋白表达以灰度值表示，标准化至β⁃actin灰度值。

1.8统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，组建比较采用student′t检验，检验水平α为0.05。统计图均采用Prism 5.0作图。

2 结果

2.1BDMC抑制db/db小鼠体质量增加和饮食增多结果如表1所示，db/db组小鼠体质量逐渐增加，在第3、6周明显高于WT组（P＜0.05），且食物、水分摄入量明显高于WT组。经BDMC和RG处理的第6周，两组小鼠体重、食物和饮水摄入量均明显低于db/db组（P＜0.05）。

2.2BDMC抑制db/db小鼠呼吸和代谢减慢结果如图1所示，db/db组小鼠全天呼吸交换比率、夜间能量消耗量明显低于WT组（P＜0.05），而白天能量消耗量没有明显的变化（图1B，P＞0.05），db/db组小鼠整体呼吸交换比率和能量消耗量明显低于WT组（P＜0.05）。经BDMC处理后，小鼠呼吸交换比率和能量消耗量均明显高于db/db组（P＜0.05）。

表1 BDMC对db/db小鼠食物、水分摄入量和体质量影响Tab.1 Effect of BDMC on food and water intake，and body weights of db/db mice±s

表1 BDMC对db/db小鼠食物、水分摄入量和体质量影响Tab.1 Effect of BDMC on food and water intake，and body weights of db/db mice±s

注：与WT组相比较，*P＜0.05；与db/db组相比较，#P＜0.05

食物摄入量（g/天）饮水摄入量（g/天）体重（g）Week 0 Week 3 Week 6 WT 2.29±0.18 3.75±0.33 21.93±0.45 25.23±1.13 32.97±0.94 db/db 4.32±0.47*5.57±0.61*22.29±0.76 29.83±1.29*40.18±2.21*db/db⁃RG 3.18±0.84#4.86±0.82#22.86±0.86 28.53±2.03 36.75±2.39#db/db⁃BDMC 3.11±0.79#4.12±0.98#23.37±0.56 28.25±1.84 37.04±2.40#

图1 BDMC对db/db小鼠呼吸交换比率和能量消耗量的影响Fig.1 Effect of BDMC on respiratory exchange rate and energy expenditure of db/db mice

2.3BDMC抑制db/db小鼠胰岛素抵抗结果如图2和表2所示，db/db小鼠空腹血糖量在实验期间逐渐增加，于第3周至6周，与外周血HbA1c、胰岛素含量、HOMA⁃IR和QUICKI均明显高于WT组（P＜0.05），经RG处理6周时，空腹血糖量、外周血HbA1c、胰岛素含量和HOMA⁃IR明显低于db/db组（P＜0.05），QUICKI没有明显的变化（P＞0.05）。BDMC处理后，小鼠空腹血糖量、胰岛素和HOMA⁃IR含量明显低于db/db组，HbA1c含量和QUICKI没有明显的变化（P＞0.05）。

2.4BDMC抑制db/db小鼠糖耐受实验各组小鼠在6周后灌胃口服葡萄糖，检测各时间点血糖。结果如图3所示，db/db小鼠血糖逐渐降低，但下降速度明显低于WT组小鼠（P＜0.05）。BDMC组小鼠血糖下降速度明显高于db/db小鼠（P＜0.05）。

2.5BDMC抑制db/db小鼠血脂升高结果如表3所示，db/db小鼠血TG、TC、FFA、LDL⁃C和HDL⁃C明显高于WT组小鼠（P＜0.05）。BDMC和RG组小鼠血TG、TC、FFA、LDL⁃C 和HDL⁃C 明显低于db/db小鼠（P＜0.05）。

图2 服用BDMC的db/db小鼠空腹血糖和血糖化血红蛋白的变化Fig.2 Changes in fasting blood glucose concentrations and blood glycosylated hemoglobin in db/db mice administered BDMC

表2 BDMC对db/db小鼠胰岛素抵抗标志的影响Tab.2 Effect of BDMC on markers of Insulin resistance in db/db mice ±s

表2 BDMC对db/db小鼠胰岛素抵抗标志的影响Tab.2 Effect of BDMC on markers of Insulin resistance in db/db mice ±s

注：与WT组相比较，*P＜0.05；与db/db组相比较，#P＜0.05

Plasma insulin（ng/mL）HOMA⁃IR QUICKI WT 2.21±0.15 14.53±2.43 0.19±0.03 db/db 4.54±0.28*89.04±10.34*0.26±0.04*db/db⁃RG 3.14±0.45#34.48±8.03#0.24±0.05 db/db⁃BDMC 2.74±0.73#55.92±9.38#&0.23±0.07

图3 BDMC对db/db小鼠口服糖耐量实验的影响Fig.3 The effect of BDMC on oral glucose tolerance test in db/db mice

表3 BDMC对db/db小鼠血脂的影响Tab.3 Effect of BDMC on plasma lipid concentrations in db/db mice ±s

表3 BDMC对db/db小鼠血脂的影响Tab.3 Effect of BDMC on plasma lipid concentrations in db/db mice ±s

注：与WT组相比较，*P＜0.05；与db/db组相比较，#P＜0.05

TC（mmol/L）TG（mmol/L）FFA（mmol/L）HDL⁃C（mmol/L）LDL⁃C（mmol/L）WT 1.83±0.12 0.75±0.06 0.43±0.03 0.93±0.15 0.69±0.15 db/db 4.64±0.34*2.45±0.08*1.31±0.12*2.54±0.23*1.12±0.24*db/db⁃RG 2.35±0.61#1.38±0.14#0.78±0.23#1.39±0.42#0.86±0.35#db/db⁃BDMC 3.54±0.65#1.71±0.32#0.96±0.27#1.75±0.43#0.92±0.64#

2.6 BDMC抑制db/db小鼠肝脏糖再生和促进糖代谢G6Pase和PEPCK是肝脏中调节糖再生和糖代谢的重要生物酶，因此检测肝脏中表达量。结果如图4所示，db/db小鼠肝脏G6Pase和PEPCK蛋白表达量明显高于WT小鼠（P＜0.05），经BDMC处理后，小鼠G6Pase和PEPCK蛋白含量明显低于db/db小鼠（P＜0.05）。

图4 BDMC对db/db小鼠糖再生和糖代谢的影响。Fig.4 The effect of BDMC on gluconeogenesis and glucose metabolism in db/db mice

2.7 BDMC抑制db/db小鼠骨骼肌葡萄糖转运AMPK信号通路调控骨骼肌中葡萄糖转运而影响葡萄糖自稳，因此检测骨骼肌中相关蛋白。结果如图5所示，db/db小鼠骨骼肌中pAMPK、PM⁃GLUT4和pAS160蛋白表达量明显低于WT小鼠（P＜0.05），经BDMC和RG处理后，小鼠pAMPK、PM⁃GLUT4和pAS160蛋白含量明显高于db/db小鼠（P＜0.05）。

图5 BDMC对db/db小鼠葡萄糖转运的影响Fig.5 The effect of BDMC on glucose transportation of db/db mice

3 讨论

2型糖尿病（T2D）及其并发症是现代社会中的重要健康问题，发病率逐年升高，且现用于临床治疗T2D的药物存在易致低血糖、耐受性等问题，同时糖尿病患者餐后血糖控制是防止糖尿病的重要环节［8］。因此，新型抗糖尿病药物的研发迫在眉睫。

BDMC是具有降血脂、抗炎作用的中药姜黄有效成分之一，具有抑制胰腺α-淀粉酶和调控PPAR⁃γ的作用而产生抗T2D效应［7，9］。文献报道称其抗糖尿病作用比姜黄的姜黄素和去甲氧基姜黄素作用强［10］。同时，BDMC调控MAPK和NF⁃κB信号通路参与炎症反应［11］，且其抗氧化作用对胰腺细胞有保护作用，抑制胰岛、肝脏、脂肪等慢性低度炎症反应［12］。因此，BDMC具有更好的抗T2D研究和治疗价值。然而，关于BDMC对T2D的效应机制研究尚不明确。

在本研究中，口服BDMC对leptin受体缺陷的T2D型db/db小鼠产生的胰岛素抵抗和糖稳态失衡产生明显的改善作用。其与PPAR⁃γ激动剂RG相比，对T2D型db/db小鼠多食、多饮和体重增加影响更为显著，对血脂的影响低于RG，提示，BD⁃MC抗T2D的机制不仅仅作用于PPAR⁃γ。因此，本研究分析其糖再生和糖代谢过程。通过检测发现，db/db小鼠在BDMC处理后，比RG处理的肝脏G6Pase和PEPCK显著降低，引起糖生成减少，血糖降低更为明显。而在骨骼肌糖转运研究中，BDMC和RG对db/db小鼠骨骼肌受抑制的AMPK⁃AS160⁃GLUT4信号通路的具有相似的上调作用［13］。因此，BDMC具有更好的抗T2D的效应，且该作用与减少肝脏糖再生和加速糖代谢有关。

综上所述，BDMC可明显改善db/db小鼠胰岛素抵抗和糖脂代谢减慢，减轻肝脏糖再生和加速糖代谢，并具有加快骨骼肌糖摄取而具有拮抗治疗T2D的潜在应用价值，且比RG具有更好的控制血糖的作用。

本研究首次发现BDMC可通过除PPAR⁃γ之外的 AMPK⁃AS160⁃GLUT4信号通路和 G6Pase和PEPCK调控2型糖尿病，具有相当的在体抑制糖再生和加速糖代谢，以及降低胰岛素抵抗的作用，并且优于罗格列酮。然而，BDMC为何对HbA1c等没有明显的作用，仍有待进一步研究。同时，而本研究为BDMC在T2D的临床治疗方面的开发提供了一定的实验依据和理论支持，其可能成为新的抗T2D的新型药物，具有广泛的临床应用前景。然而，BDMC对T2D保护作用的其他机制仍然有待研究，且T2D病人常存在遗传性改变和饮食类别差异等多样影响因素，因此BDMC的抗T2D机制仍需要更多的探究。