何锦园 陈雪霞 胡柳 黄邵洪

1中山大学附属第三医院心胸外科（广州 510630）；2中山大学附属第一医院东院护理部（广州 510630）；3中山大学附属第七医院心胸血管外科（广东深圳 518107）

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，也是最常见的死因之一［1］。肺癌的病因复杂，经多学科综合治疗近年来五年生存率有所提升，但总体而言预后不良［2］。因此研发新的治疗方法有积极意义。

肿瘤免疫耐受是指肿瘤通过某些机制逃过机体的免疫系统监视，生长不受机体控制［3］。肿瘤免疫耐受的机制尚未完全清楚［4］，肿瘤免疫耐受细胞的产生是其机制之一［5］。免疫耐受细胞数众多，可产生白介素（IL）⁃10，转化因子（TGF）⁃beta等在内的免疫耐受分子［6］。产生IL⁃10的B淋巴细胞被称为B10细胞［7］，是免疫耐受细胞家族一员，在肿瘤免疫耐受起重要作用［8］。通过产生IL⁃10，B10细胞能够抑制免疫效应细胞活性，降低机体抗肿瘤能力［9］。有报道显示，肿瘤患者体内免疫耐受细胞数量增加［10］，但具体成因目前尚不清楚。

最新研究［11］表明micro RNA（miR）能够调节某些细胞因子表达。miR是长度为18-22个核苷酸的单链RNA，在转录后阶段能调节靶基因的表达。LIU等［12］报道miR⁃98能够抑制巨噬细胞IL⁃10的表达。外源性miR⁃98能否调节肿瘤个体B淋巴细胞白介素的表达目前尚无研究。由此，笔者推测miR⁃98表达障碍导致了肺癌患者B10细胞IL⁃10升高。本研究旨在验证miR⁃98通过抑制肺癌患者B10细胞IL⁃10的表达而抑制肿瘤生长。

1 材料与方法

1.1研究对象收集中山大学附属第三医院2016年2月至2016年4月首诊为非小细胞肺癌（由外科医师和病理科医师共同确诊）的患者外周血标本共10例，其中男5例，女5例，平均年龄55.4岁，有吸烟史患者3例，以气胸患者外周血标本10例作为对照组。本研究对象的排除标准为：（1）肺癌复发，（2）使用免疫抑制剂，（3）伴有自身免疫性疾病或其他器官严重疾病。研究设计和过程经过中山大学临床伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1血样采集与单核细胞的分离外周血样由上肢静脉采集，每位受试者30 mL。外周血单核细胞（PBMC）通过梯度密度离心法分离。

1.2.2B淋巴细胞分离与培养CD19B淋巴细胞通过免疫磁珠分离获得，按试剂盒（Mitenyi Bio⁃tech）使用手册操作。B淋巴细胞纯度通过流式细胞仪检测，超过98%为合格，培养基为RPMI1640，加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺及 20 ng/mL anti⁃CD40抗体，2～3 d换1次液。细胞活性通过台盼蓝试验评估，超过98%者可用于实验。

1.2.3外周血B10细胞频率测定将分离获得的PBMC用FITC标记的anti⁃CD19单抗或同型IgG（BD Bioscience）于4℃下染色30 min，PBS冲洗3遍，1%多聚甲醛固定30 min，0.5%皂素孵育10 min，APC标记的anti⁃IL⁃10 单抗（BD Bioscience）4℃下染色30 min，置于流式细胞仪（BD Bioscience）下分析。结果由Flowjo（TreeStar）软件分析处理。同型IgG染色的细胞数据作为基线参考。

1.2.4实时定量PCR检测B淋巴细胞miR⁃98和IL⁃10 mRNA用TRIzol试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，制备获得DNA第一单链，加入SYBR Green Master Mix，miR⁃98和IL⁃10引物分别为gttctttgggg⁃agccaacag和gctccctggtttctcttcct（由中国深圳Enke Biotech公司设计），置于实时定量PCR仪（Bio rad）扩增，结果用2-△△Ct法计算，表示为对照组倍数。

1.2.5miR⁃98脂质体制备分别取胆固醇、1，2-二油酰基卵磷酸钠和磷脂酰胆碱各100 mg溶于氯仿4.5 mL中，氯仿蒸发后获得脂质薄膜，抽取10 mg脂质薄膜加入0.5 mg miR⁃98质粒（Enke Bio⁃tech，Shenzhen，China）或0.5 mL生理盐水（对照），混匀10 min，加热至60℃并震荡15 min，蒸馏水反复冲洗备用［13］。

1.2.6B淋巴细胞miR⁃98的高表达测定将miR⁃98脂质体（10 μg/mL）加入对照组外周血提纯的B淋巴细胞培养液中，24 h后收取细胞用以后续试验，经qRT⁃PCR检测，miR⁃98在B淋巴细胞中表达增高约5倍。

1.2.7miR⁃98脂质体对B淋巴细胞IL⁃10表达的抑制效果由对照组外周血中提取B淋巴细胞，miR⁃98高表达和野生型B淋巴细胞均加入1 μg/mL LPS刺激48 h，qRT⁃PCR检测IL⁃10表达。

1.2.8肺癌小鼠模型的建立肺癌小鼠模型由6～8周龄SPF级别、体重约18～20 g的雄性BALB/c小鼠建立（购自广东医学实验动物中心，许可证号为SYXK（粤）2016⁃0122），饲养温度为21℃ ±2℃，相对适度为30%～70%。肺癌细胞株KLN205（ATCC）在 Dulbecco′s Modified Eagle Medium 中培养，每日更换培养液，细胞活性通过台盼蓝试验评估，超过99%者用于进一步试验。每只小鼠背部皮下注射10E6肺癌细胞，每日测量记录一次瘤体大小。实验用小鼠通过中山大学动物中心认证，过程遵循相关规定。

1.2.9miR⁃98脂质体抑制瘤体生长的观察在试验第0、4和8天，荷瘤小鼠通过腹腔内注射miR⁃98脂质体（0.2 mg/只）或对照脂质体，每日测量记录一次瘤体大小。

1.3统计学方法数据的正态分布用微软公司Excel Norm.DIST验证。定量资料两组间差异用t检验，多组别间差异用单因素方差分析ANOVA法，两组间相关分析用微软公司Excel进行，P＜0.05为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1肺癌患者外周血B10细胞增高经流式细胞术检测，实验组10例肺癌患者外周血B10细胞数显著高于健康对照组（14.2%vs.2.74%，P＜0.000 1，图1），实验结果证实肺癌患者B10细胞增加。

2.2肺癌患者外周血B淋巴细胞miR⁃98表达降低从PBMC中提取CD19B淋巴细胞（图2A），qRT⁃PCR检测结果显示肺癌患者外周血B淋巴细胞miR⁃98表达仅为对照组的0.19倍，而健康受试者为对照组0.44倍（图2B）。经检测B10细胞IL⁃10表达水平，结果显示肺癌患者较健康受试者显著升高（1.55 vs.0.21，P ＜0.000 1，图2C）。B淋巴细胞miR⁃98与IL⁃10相关分析显示，二者呈负相关（r=-0.779 3，P ＜0.000 1）（图2D）。这些结果提示，miR⁃98可能是B淋巴细胞IL⁃10的抑制因子，而肺癌患者B淋巴细胞miR⁃98减少可能造成IL⁃10表达增加。

2.3miR⁃98高表达抑制B淋巴细胞IL⁃10为阐明miR⁃98在B淋巴细胞IL⁃10表达中的调节作用，通过转染miR⁃98质粒获得高miR⁃98表达的B淋巴细胞，转染使B淋巴细胞miR⁃98表达升高了6倍（图3A）。miR⁃98高表达和野生型B淋巴细胞经LPS刺激产生IL⁃10。经qRT⁃PCR检测，野生型B淋巴细胞IL⁃10表达增加，为对照组1.46倍，而miR⁃98高表达的B淋巴细胞仅为0.16倍（图3B）。结果证实，B淋巴细胞miR⁃98对IL⁃10表达有抑制作用。

图1 流式细胞术-肺癌患者外周血B10细胞数增高Fig.1 Peripheral B10 cells are more in patients with lung cancer

图2 miR⁃98和IL⁃10 mRNA在外周血中的评估Fig.2 Assessment of miR⁃98 and IL⁃10 mRNA in peripheral B cells

2.4 miR⁃98脂质体抑制荷瘤小鼠肺癌生长荷瘤小鼠模型接受3次间隔3 d的miR⁃98脂质体腹腔内注射，之后12 d每天测量记录一次瘤体大小，结果显示应用miR⁃98脂质体显著抑制瘤体生长（图4A）。12 d后处死小鼠，采集外周血检测B10细胞数量，结果显示注射生理盐水荷瘤小鼠B10细胞数量显著高于对照小鼠，给予miR⁃98脂质体荷瘤小鼠B10细胞数量显著降低（图4B⁃C）。结果证实：应用miR⁃98脂质体抑制荷瘤小鼠B淋巴细胞IL⁃10表达，进而抑制肺癌生长。

3 讨论

图3 MiR⁃98抑制B 淋巴细胞IL⁃10的表达Fig.3 MiR⁃98 inhibits IL⁃10 expression in B cells

图4 MiR⁃98脂质体抑制B10细胞和肿瘤生长Fig.4 MiR⁃98⁃carrying liposomes inhibit B10 cells and suppress tumor growth

B10细胞在肿瘤免疫耐受中有重要作用，协助癌细胞逃避机体免疫监视［9］。最新研究显示，肺癌患者B10细胞较健康人群高，而外周血B淋巴细胞miR⁃98降低，IL⁃10增高，二者呈负相关，这提示miR⁃98能抑制B淋巴细胞IL⁃10表达。本研究同样证实了上述观点，荷瘤小鼠注射miR⁃98脂质体显著抑制瘤体生长并减少外周血B淋巴细胞数量，虽然miR⁃98未能完全清除肿瘤，但显著抑制了瘤体生长，这使其有望成为肺癌治疗的一个新手段。

本研究发现，肺癌患者外周血B10细胞较健康受试者显著升高。产生IL⁃10的T和B细胞有免疫调节功能，例如Ⅰ型免疫调节T细胞和B10细胞［14-15］。在适当的刺激因子作用下，免疫调节T或B淋巴细胞释放IL⁃10抑制其他细胞免疫功能，进而抑制免疫反应［16］。一方面这可能对机体有利，比如抑制炎症［16］，另一方面，对于癌症患者则是有害的，因为免疫调节细胞会抑制肿瘤特异性免疫，比如抑制肿瘤特异性CD8+T细胞［17-18］。

阐明肿瘤患者B淋巴细胞IL⁃10高表达的机制有重要意义。文献［12］报道，miR⁃98能抑制巨噬细胞IL⁃10表达，肺癌患者B10细胞升高这一现象提示miR⁃98在B淋巴细胞的表达可能存在异常。这一推论得到实验数据支持：肺癌患者B淋巴细胞miR⁃98表达较健康人显著降低。有研究指出，IL⁃10基因3′UTR处有miR⁃98结合位点，miR⁃98能与之结合从而抑制IL⁃10表达［12］。以脂质体作为载体，我们构建了携带miR⁃98的脂质体，用miR⁃98脂质体处理荷瘤小鼠后，瘤体体积和外周血B10细胞数较生理盐水对照组均显著减少。

总之，本研究结果表明，肺癌患者外周血B淋巴细胞miR⁃98低表达而IL⁃10高表达；增加miR⁃98表达抑制B淋巴细胞IL⁃10表达，这为miR⁃98脂质体作为肺癌潜在的治疗手段提供了重要的理论依据，这是价值所在。但本研究也存在一定的不足，本研究只在基因水平验证了miR⁃98与IL⁃10的负相关的关系，未从蛋白水平进一步验证。由于受人体伦理影响，标本例数偏少，下一步研究尚需加大样本量。