邓洋洋 李佳 孙鑫 蒋宁 郑洪新

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

骨质疏松症的发病原因和发病机制都十分复杂。从本研究的角度来看，人体内的骨骼是具有高度血管化的组织[1]，由于骨组织微循环障碍的原因，影响到骨骼内环境的改变，导致骨形成障碍。有研究将骨质疏松症列为血管老化性老年疾病之一[2]。因此本研究以Ang-1为切入点，并且观察补肾填精、活血化瘀、补肾活血三种不同治法对其的影响，以期进一步探究骨质疏松症的发病机制以及更有效的中医治法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级SD大鼠，雌性，3～4月龄，60只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2实验药品：①补肾填精中药复方：左归丸出自《景岳全书》卷五十一新方八阵方。组成：熟地、山药、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟丝子、鹿胶、龟胶。②活血化瘀中药复方：身痛逐瘀汤出自《医林改错》。组成：秦艽、川芎、红花、桃仁、甘草、羌活、当归、没药、灵脂、牛膝、香附、地龙。③补肾活血中药复方：由左归丸与身痛逐瘀汤加减。组成：菟丝子、熟地、龟胶、鹿胶、川芎、川牛膝、桃仁、红花。④阳性对照药：骨疏康颗粒。主治功效：补肾益气，活血壮骨。

1.1.3主要试剂和仪器：ELISA试剂盒(美国R&D systems公司)、逆转录试剂盒(日本Takara公司)等。双能X线骨密度分析仪(美国 Lunar公司)以及手术器械等。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物饲养条件：大鼠购进后于SPF级实验室饲养，温度：24 ℃；湿度：40%，照明昼夜明暗交替。按体重分层随机分组，正常组10只，其余进行造模处理。

1.2.2实验动物模型建立：采用一次性手术摘除大鼠双侧卵巢造模方法。术后给与造模大鼠青霉素肌肉注射，连续注射3 d。存活后进行分组。

1.2.3实验动物分组：术后3 d将存活大鼠，按体重分层随机分为5组，模型空白组，补肾填精组，活血化瘀组，补肾活血组，阳性对照组。

1.2.4实验给药方法：实验动物分组2 d后开始给药，各个用药组药量按人体公斤体重(g/kg)每日用药量的6.3 倍计算，体积为1 mL/100 g，正常组、模型空白组给予等量生理盐水，给药12 周。

1.2.5标本采集与检测：给药12 周后，各组大鼠在24 h禁食后采集大鼠双侧股骨。左侧股骨取出后，生理盐水冲洗，纱布包好后封于塑料保鲜密封袋，应用双能X线骨密度分析仪对大鼠离体左侧股骨进行骨密度检测。右侧股骨取出后，一部分用锡纸包好后，存入-70°冰箱保存，用于骨组织Ang-1蛋白含量测定，具体检测步骤按ELISA试剂盒说明书进行。一部分放入有Trizol液的EP管中，用于骨组织Ang-1 mRNA表达测定，使用Primer-BLAST设计引物，引物序列见下表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠股骨骨密度结果

实验各组大鼠骨密度结果，见表2，与正常组比较，模型空白组大鼠骨密度显著降低(P<0.01)，说明骨质疏松症模型造模成功。用药12周后，补肾填精组、活血化瘀组、补肾活血组以及阳性药物对照组均可以提高大鼠股骨骨密度，与模型空白组相比，其中补肾填精组、补肾活血组以及阳性药物对照组差异有显著统计学意义(P<0.01)，活血化瘀组差异有统计学意义(P<0.05)。说明补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方均具有提高去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨密度，防止骨质丢失的作用。

表2 各组大鼠股骨骨密度检测结果比较Table 2 Comparison of BMD of the femur among

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型空白组比较，##P<0.01。

2.2 各组大鼠骨组织中Ang-1mRNA及其蛋白表达

各组大鼠股骨中Ang-1mRNA见表3和4。与正常组比较，模型空白组大鼠Ang-1mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；与模型空白组比较，各个用药组即补肾填精组、活血化瘀组、补肾活血组以及阳性对照组均显著升高(P<0.01)；各个用药组间比较无统计学意义。

各组大鼠股骨中Ang-1蛋白：与正常组比较，模型空白组大鼠Ang-1含量显著降低(P<0.01)；与模型空白组比较，各个用药组即补肾填精组、活血化瘀组、补肾活血组以及阳性对照组均显著升高(P<0.01)；各个用药组间比较，补肾活血组Ang-1含量升高最为显著，与补肾填精组和活血化瘀组比较有显著性差异(P<0.01)，此外，补肾填精组Ang-1蛋白表达含量显著高于活血化瘀组(P<0.01)。

表3 大鼠股骨中Ang-1mRNA相对表达量结果Table 3 The expression of Ang-1 mRNA of the

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型空白组比较，##P<0.01。

表4 大鼠股骨中Ang-1蛋白含量结果Table 4 The expression of Ang-1 protein of the

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型空白组比较，##P<0.01；与补肾填精组比较，●●P<0.01；与活血化瘀组比较，◆◆P<0.01。

3 讨论

3.1 骨质疏松症的中医病因病机——肾虚血瘀、血不养骨

中医历代文献中没有骨质疏松症的病名，但从其发病和症状上看，多属于“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”等范畴。《素问·宣明五气》说：“肾主骨”，又《灵枢·经脉》说：“足少阴气绝，则骨枯”。中医学认为精是人体生命活动中最重要的物质基础，藏之于肾，肾精是人体生长发育及各种生理功能的源泉物质。人体的骨骼得到充足的肾精滋养才能正常的发育生长或维持坚实的状态，如果骨失去肾精的充养，可导致骨骼的生长障碍或退化，造成骨质疏松症。另一方面，《素问·五藏生成》说：“足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能摄。”说明人体骨骼等全身各个部分必须有血液的供应才能发挥正常的生理功能。“精血同源”，即肾精化血，血又化精，故血液濡养骨骼也是“肾主骨”的重要生理表现之一。如精血不足或瘀血阻滞等各种原因，血液不养骨骼和骨髓，骨骼失于充养，也可造成骨质疏松症。由此可见，骨质疏松症的中医病因病机主要在于肾虚血瘀、血不养骨。所以针对上述病因病机本次实验采用补肾填精、活血化瘀以及补肾活血中药复方进行干预治疗，并且观察三种不同治疗方法的疗效比较。实验结果提示，补肾填精、活血化瘀以及补肾活血中药复方均可以提升大鼠股骨骨密度，促进骨骼修复，对骨质疏松症起到防止的作用。

3.2 Ang-1和Hedgehog信号与骨质疏松症的关系

本实验团队前期研究发现，骨质疏松症的发生机制与Hedgehog信号传导通路中SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性下降有关；补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方通过激活Hedgehog信号传导通路中的SHH、GLI1，以促进骨形成，抑制骨吸收，起到防止骨质疏松症的作用[3]。有国外学者研究发现，Hedgehog信号通路被激活后，可以调控其下游相关基因如血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang-1)等[4]。在动物骨骼肌后肢缺血模型中，缺血组织处间充质干细胞中Shh mRNA和蛋白表达增多，Shh诱导新生血管形成，上调血管生长因子如VEGF和血管形成素Ang-1的表达，促进缺血处肌肉再生，有利于缺血肢体功能恢复[5]。

现代医学表明，骨是高度血管化的组织，骨新生依赖良好的血供和营养支持，血管和骨细胞之间紧密的时空联系维持了骨骼的完整性。因此，在骨骼发展和骨折修复期间，血管形成起着相当重要的作用。同样，在传统输送盘牵张成骨过程中要求各骨段上要有充足的血液供应，以保证牵张过程中旺盛的代谢活动、超常的营养供应及各骨段组织的正常代谢[6]。

那么，骨质疏松症的发生是否与血管生成素的变化有关，而骨质疏松症的中医病因病机表明肾精-骨-血之间具有紧密的联系，因此本研究，选取Ang-1作为观察指标，试探究骨质疏松症的发病机制与其关系。实验结果提示：正常大鼠骨组织中可以表达Ang-1，与正常组比较，模型空白组大鼠Ang-1mRNA相对表达量显著降低；说明模型空白组大鼠骨骼血供能力减弱，骨失所养，而发生了骨质疏松症。与模型空白组比较，各个用药组均能使Ang-1 mRNA相对表达量显著升高，说明通过12周灌胃给药后，补肾填精、活血化瘀、补肾活血法进行治疗可以提高大鼠骨组织中Ang-1的生成。正常大鼠骨组织中可以表达Ang-1蛋白，与正常组比较，模型空白组大鼠Ang-1含量显著降低；与模型空白组比较，各个用药组即Ang-1含量显著升高；各个用药组间比较，补肾活血组Ang-1含量升高最为显著，与补肾填精组和活血化瘀组比较有显著性差异。说明，针对去卵巢骨质疏松症模型大鼠的干预治疗中，以补肾活血中药复方疗效最为显著，优于补肾填精组和活血化瘀组。这说明针对原发性骨质疏松症的治疗，可以采用以补肾填精法为主，辅以活血化瘀，达到更优化的治疗。