刘子宁，陈 凡，殷 麟，冯瑞兴，蔡俊涛，林 晶，李 鹏

(1.青海大学医学院;2.青海大学附属医院;青海 西宁810001)

放射性心脏损伤(Radiation－induced heart disease，RIHD)早期常因无明显临床症状而易被忽视，晚期则会发生不可逆的心功能减退甚至猝死等严重的并发症。放射治疗引起的心血管疾病造成的死亡率仅次于肿瘤本身复发及转移所导致的死亡［1］。

线粒体组织对辐射敏感。心肌细胞中含有大量的线粒体，辐射会造成其形态学上的改变及持续的功能改变，激活细胞的线粒体凋亡途径［2］。RIHD晚期损伤的发生与心肌细胞凋亡水平的增高有着重要的关系。Bcl－2家族是线粒体凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子［3］:Bcl－2可增加谷胱甘肽的表达，改变细胞的氧化还原平衡降低半胱天冬酶的活性，从而抑制细胞凋亡;Bax可与Bcl－2生成异源二聚体使Bcl－2失活，从而促进细胞的凋亡。细胞的凋亡水平与细胞内Bcl－2/Bax表达比率关系密切［4］。

红景天苷是红景天的主要成分之一，其具有保护缺血再灌注小鼠模型心肌组织，减轻心脏损伤的作用;并能降低慢性心衰大鼠模型心肌细胞凋亡水平。［5－6］RIHD 尚缺乏有效的防治方法，本研究拟通过建立RIHD小鼠模型探讨红景天苷对RIHD的保护作用及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取4周龄SPF级昆明小鼠75只［动物合格证号:SCXX(军)2013－14］，雌雄各半，体重 20±2 g，随机分为5组:空白组(16只)、10 Gy组(16只)、10 Gy+干预组(16只)、20 Gy组(16只)、20 Gy+干预组(16只)，适应性喂养一周，雌雄分笼饲养。

1.2 主要仪器与试剂

23EX医用直线加速器(美国瓦里安公司)，酶标仪9602(北京朗普提科技公司)，红景天苷(上海哈灵生物科技有限公司，纯度:98%)，小鼠B细胞淋巴瘤因子2(Bcl－2)抗体、小鼠Bcl2关联X蛋白(Bax)抗体(武汉博士德公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 RIHD 小鼠模型建立

小鼠在照射前5 min前称重，腹腔注射0.5%戊巴比妥0.2 mL进行麻醉，麻醉后固定四肢，置于医用直线加速器治疗床上，激光定位于心脏部，设置1 cm×1 cm照射野，源皮距100 cm，剂量率3 Gy/min。照射后等小鼠自然苏醒放回原处饲养，并记录小鼠照射后的一般情况。

1.3.2 红景天苷干预

小鼠照射后对干预组小鼠给予红景天苷［50mg/(kg·d)］灌胃给药，对照组和单纯照射组给予相同体积蒸馏水灌胃，持续7 d。

1.3.3 取材

分别于照射后1、2、4 w称重后以颈部脱臼法处死小鼠，开胸取出小鼠心脏组织放入－80℃冰箱低温保存。

1.3.4 Bcl－2、Bax 的表达检测

用蛋白质印迹法(Western Blot，WB)检测Bcl－2、Bax的表达。取少量心脏组织加入裂解液匀浆，离心(4℃，10000g，2min)取上清液，依次经过制胶及上样、电泳、转膜、封闭后，加入一抗抗体(Bax为1:1000，Bcl－2 为1:1000)，孵育过夜(4℃)，TTBS洗膜，振荡(37℃，60min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，Bax为 1:2000，Bcl－2 为 1:2000)。TTBS 再洗膜后置ECL混合液中温育(5min)，然后曝光、显影、定影，扫描，分析蛋白图像。

1.4 统计学方法

使用SPSS19.0统计软件进行统计分析，数据均采用珋x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较用LSD 法。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 一般状况的观察

各小组小鼠均未出现死亡情况。对照组小鼠进食饮水量、活动度未发现明显变化，体重随时间逐渐增加。20 Gy组与20 Gy+干预组照射后一周与对照组相比较体重变化有统计学意义(P＜0.05)，10 Gy组与10 Gy+干预组与对照组相比较无统计学意义(P＞0.05);第二周各实验组小鼠进食饮水量明显减少，活动度明显减弱，各实验组体重变化与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05);随着时间的延长各实验组小鼠的进食饮水量逐渐恢复，第四周体重较本组第二周时有明显的增长，20 Gy组与对照组仍有统计学差异(P＜0.05)，其他实验组与对照组相比较无统计学差异。红景天苷干预组与同等照射剂量的单纯照射组比较，干预组体重略高于单纯照射组，照射后4周20 Gy+干预组与20 Gy组体重相比较有统计学差异性(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠不同时间体重变化情况(±s，g)Table 1 Changes of each group’s weightat different time in mice(±s，g)

表1 各组小鼠不同时间体重变化情况(±s，g)Table 1 Changes of each group’s weightat different time in mice(±s，g)

*:与对照组比较P＜0.05;#:与相同照射剂量的单纯照射组比较P＜0.05.

组别 n 照射前 1 w 2 w 4 w对照组 5 24.71±1.69 30.40±1.66 34.10±1.40 37.01±1.72 10 Gy 组 5 25.09±1.83 30.36±1.12 31.41±1.61* 36.59±1.59 20 Gy 组 5 24.93±1.91 27.47±1.13* 29.71±1.15* 32.49±1.56*10 Gy+干预组 5 24.98±1.65 30.38±1.43 32.66±1.53 36.22±2.15 20 Gy+干预组 5 25.63±1.61 27.80±1.13* 30.61±1.28* 35.67±1.65#F 0.195 6.393 7.265 5.352 P 0.938 0.002 0.001 0.004

2.2 红景天苷对各组RIHD小鼠Bcl－2及Bax表达的影响

用WB法检测发现:各试验组小鼠照射1 w后Bcl－2及Bax的变化最为明显，随着放射剂量的增加，Bcl－2表达逐渐减少，Bax的表达逐渐增多，且与对照组相比较有显著统计学意义(P＜0.05);随着时间的增加，各组小鼠Bax的表达逐渐降低，但与对照组相比仍有统计学意义(P＜0.05)。红景天苷可以增加Bcl－2、减少Bax的表达，红景天苷干预组与相同照射剂量的单纯照射组相比，Bcl－2、Bax的表达均有统计学差异(P＜0.05)。见图1、表2。

图1 各组小鼠Bcl－2及Bax的表达情况(β－actin为内参)Figure 1 Expression of Bcl－2 and Bax in mice of each group(β－actin as an inner control)

表 2 各组小鼠不同时间 Bcl－2、Bax 表达情况(±s)Table 2 Expression of Bcl－ 2 and Bax at different time in mice of each group( ±s)

表 2 各组小鼠不同时间 Bcl－2、Bax 表达情况(±s)Table 2 Expression of Bcl－ 2 and Bax at different time in mice of each group( ±s)

*:与对照组比较P＜0.05;#:与相同照射剂量的单纯照射组比较P＜0.05.

Bcl－2/β－actin Bax/β－actin组别 n 1 w 2 w 4 w 1 w 2 w 4 w对照组 5 1.182±0.087 1.120±0.062 1.206±0.052 0.428±0.043 0.418±0.041 0.435±0.036 10 Gy 组 5 0.998±0.055* 1.021±0.068* 1.143±0.071 0.949±0.069* 0.858±0.051* 0.560±0.059*20 Gy 组 5 0.757±0.062* 0.817±0.062* 0.998±0.055* 1.412±0.067* 1.318±0.046* 1.007±0.088*10 Gy+干预组 5 1.116±0.069# 1.114±0.084# 1.121±0.044 0.781±0.046*# 0.679±0.041*# 0.468±0.045 20 Gy+干预组 5 0.831±0.029* 1.022±0.071*# 1.087±0.063*# 1.201±0.093*# 1.093±0.071*# 0.733±0.087*#F 42.210 19.682 11.618 164.865 228.681 61.753 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 红景天苷对各组RIHD小鼠Bcl－2/Bax的影响

小鼠接受照射后Bcl－2/Bax的表达显著降低，各实验组与对照组、单纯放射组与红景天苷干预组之间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。本研究结果显示，红景天苷可以显著提高 RIHD小鼠Bcl－2/Bax的表达水平。见表4。

表3 各组小鼠不同时间Bcl－2/Bax表达情况(±s)Table 3 Expression of Bcl－ 2/Bax at different time in mice of each group( ±s)

表3 各组小鼠不同时间Bcl－2/Bax表达情况(±s)Table 3 Expression of Bcl－ 2/Bax at different time in mice of each group( ±s)

*:与对照组比较P＜0.05;#:与相同照射剂量的单纯照射组比较P＜0.05.

组别 n 1 w 2 w 4 w F P对照组 5 2.799±0.502 2.867±0.352 2.790±0.315 0.055 0.947 10 Gy 组 5 1.054±0.076* 1.189±0.027* 2.051±0.177* 115.435 0.000 20 Gy 组 5 0.564±0.074* 0.620±0.033* 0.996±0.088* 70.384 0.000 10 Gy+干预组 5 1.430±0.082*# 1.648±0.201*# 2.601±0.253# 52.091 0.000 20 Gy+干预组 5 0.690±0.054*# 0.940±0.112*# 1.506±0.249*# 33.617 0.000 F 74.037 106.575 52.815 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

RIHD是射线诱导的一种进行性加重的疾病，以前普遍认为心脏是放射耐受组织。近些年来有文献报道心脏受到正常组织耐受剂量范围之内的辐射也会导致心脏损伤，特别是迟发型心肌损伤问题日益突出［7－8］。随着放射各学科的快速发展以及科技水平的不断进步，肿瘤放射治疗的疗效有了显著的提高，且放疗副反应有了明显改善，然而由于解剖结构的复杂性，RIHD的发生无法完全避免。近些年来RIHD越来越受到学界的重视。然而RIHD缺少有效的治疗方法，只能预防，目前RIHD的治疗与一般心肌病治疗类似，给予休息、吸氧和钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、强心利尿剂治疗等对症处理(不能从本质上解决RIHD的损害)。

急性RIHD的损伤常发生在放疗后3个月以内，常以进行性加重的非特异性炎症损伤为主(如急性放射性心包炎、心肌炎等)，并会出现心肌酶的异常、心肌电生理的改变等，通常没有明显的临床症状，不被医生所重视;而慢性RIHD则发生在放射治疗后的1年甚至数年后，常会发生严重的病变:由急慢性渗出性心包炎发展成缩窄性心包炎、放射性冠脉损伤、无症状的心功能减退等改变，严重者可能发生心力衰竭甚至猝死，偶有心脏瓣膜功能异常［9］。RIHD的发生与心肌心包组织的炎症及纤维化、线粒体功能异常、毛细血管受损等密切相关［10］。本研究发现放射会引起心脏组织Bcl－2的表达降低及Bax的表达升高;引起Bcl－2/Bax的表达显著降低，且随着放射剂量的增加升高更明显(P＜0.05)。随着时间的增加，各组Bcl－2的表达逐渐升高，Bax的表达逐渐降低，但Bcl－2/Bax的表达仍处于较低水平。Bcl－2/Bax持续低水平表达，会上调心肌细胞的凋亡水平。在正常的生理状态下，心肌细胞属于永久性细胞，凋亡水平持续增高会对心脏造成不可逆的损伤［11］。

对于RIHD高危人群或有心脏基础疾病患者，尽早使用保护心血管药物会减少或减轻RIHD的发生及危害程度。Van der Veen等［12］研究显示，卡托普利能够减轻放射线照射引起的小鼠心肌纤维化及心包积液，减轻急性RIHD症状而改善心脏功能。吴荣等［13］研究证实，氯沙坦能够通过下调血管紧张素Ⅱ受体及核因子κB的表达来实现对大鼠RIHD的保护作用。放射治疗期间给予抗炎药物、抗氧化药物同样可以起到心脏保护作用。国内亦有中药预防 RIHD 的研究［14－15］:生脉注射液、丹红注射液等可以显著降低血清心肌酶、肌钙蛋白的异常，对RIHD有一定防治作用。

红景天苷是红景天属植物中广泛存在的一种天然酚类次生代谢产物，可从植物根、茎提取，亦可通过生物化学合成途径合成［16］。红景天苷具有抗缺血缺氧、抗肿瘤等作用。红景天苷可以提高小鼠在不同缺氧状况下的生存能力，对缺氧有保护作用;减轻心肌细胞缺血再灌注损伤，降低乳酸脱氢酶和磷酸激酶的水平;降低慢性心衰大鼠模型心肌细胞Bcl－2/Bax的表达;诱导人类乳腺癌细胞模型中癌细胞周期阻滞和细胞凋亡［17－18］。本研究通过红景天苷灌胃干预RIHD小鼠模型，发现红景天苷可以上调Bcl－2、下调Bax的表达水平(P＜0.05)，从而降低心脏组织的凋亡水平，对心脏发挥保护作用。

我们通过建造不同剂量RIHD小鼠模型开展相关实验研究，为红景天苷防治RIHD的其他相关研究提供理论依据和实践参考。本实验亦存在一定的局限性:未设置红景天苷浓度、时间梯度，还需进一步完善相关研究。