胡方杰，乔丽娟，俞科贤，蒲小燕，永 胜，刘 燕，许玉珍，李积东

(青海大学基础医学院，西宁810001)

观察发现，长期处于低氧环境下者机体免疫功能出现紊乱［1，2］。本研究采用模拟海拔5 000 m低氧和常氧对照条件分别饲养小鼠30天，通过测定各组小鼠脾脏指数、脾脏T淋巴细胞的数量及增殖能力和细胞培养上清液中细胞因子(IL－4、IFN－γ)的含量，初步揭示低氧对小鼠脾脏T淋巴细胞免疫功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验研究对象为20只健康雄性BALB/c小鼠，5～7周龄，于西安交通大学医学院动物实验中心购买［SCXK(陕)2012－003］，体重(15±1)g。主要试剂和仪器:抗小鼠CD3抗体(CD3－PE)、抗小鼠CD4抗体(CD4－FITC)、抗小鼠 CD28抗体(CD28－FITC、CD28－PerCP)及抗小鼠 CD8 抗体(CD8－Per-CP)(eBioscienc公司)，FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)，红细胞裂解液、噻唑蓝、RPMI1640培养基(Solarbio公司)，伴刀豆球蛋白A(Sigma公司)，IL－4/IFN－γ的 Elisa试剂盒(Trut Specialty Zeal公司);低压氧舱室(中国贵州，DYC－3000)，流式细胞仪(BD公司，E34297600466，美国)，酶联免疫检测仪(Bio－Rad公司，Coda型，美国)，CO2培养箱(Thermo公司，380系列，美国)。

1.2 方法

1.2.1 构建低氧动物模型

本实验组别有低氧组(A)和常氧对照组(C)，每组10只。其中C组在平均海拔400 m的西安交通大学医学院饲养，A组在青海大学医学院高原医学研究中心模拟5 000 m海拔的低压氧舱中饲养，两组小鼠饲养条件相同，常规分笼饲养30天。

1.2.2 检测小鼠脾脏指数

称重并记录数据，给予两组小鼠0.8 mL/100 g的10%乌拉坦行腹腔麻醉，无菌剖离获取小鼠脾脏，去除脾脏表面附着的结缔组织，称重并记录数据，计算小鼠脾脏指数:即脏器指数=脾脏质量/小鼠体重×100%。

1.2.3 制备小鼠脾脏细胞

将称重过的脾脏迅速置于含有2 mL的Hanks液中剪成三段，研磨脾脏获取细胞悬液，经200目尼龙网过滤细胞悬液并将其移至1.5 mL无菌离心管中，离心(1500r/min，4℃)5 min，弃上清液;加入红细胞裂解液混匀静置5 min，再离心(1500r/min，4℃)5 min弃上清液;用1 mL Hanks液清洗两遍，每次均离心(1500r/min，4℃)5 min后弃上清液;用PBS将其制成细胞悬液，并用PBS调整其细胞浓度至 1.5×106个/mL，待用。

1.2.4 检测小鼠脾脏T淋巴细胞数量

取500μL现制备好的细胞悬液置于流式管中作为阴性对照，再取500μL的细胞悬液与带有荧光标记的单克隆抗体混合均匀作为样品管，避光静置30 min 后离心(1500r/min，4℃)2 min，弃上清液，并用1 mL的PBS清洗3遍，再用500μL的PBS重新制成细胞悬液，按照流式细胞仪操作说明书操作，检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的分布情况。

1.2.5 检测小鼠脾脏T细胞的增殖能力

在96孔板中依次加入 100μL终浓度为5μg/mL的 ConA 和浓度为 1.5×106个/mL的细胞悬液100μL(混匀)作实验组，只加等体积细胞悬液者作阴性对照组，各设置3个复孔，于CO2培养箱(37℃、50mL/L)中培养48 h;将20μL MTT溶液加入各孔中培养4 h，离心弃上清液，再将150μL DMSO加入各孔中，低速震荡15 min，最后使用酶标仪检测490 nm处各孔吸光度值。

1.2.6 检测脾脏细胞培养上清中 IL－4、IFN－γ 的含量

收集已在37℃、50 mL/L CO2条件下培养48 h的细胞培养上清液，并按照IL－4、IFN－γ的Elisa试剂盒说明书进行操作，最后使用酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值。

1.2.7 统计学分析

统计学分析采用SPSS22.0软件，计量资料以珋x±s表示，组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 高原低氧促进小鼠脾脏指数的升高

饲养 30 天后，C 组小鼠体重为(23.172±0.597)g，A 组小鼠体重为(19.718±0.541)g，A 组小鼠体重明显低于C组小鼠(P＜0.001);A组小鼠脾脏净重和C组无明显差异(P=0.447)，但A组小鼠脾脏指数明显高于 C 组(P＜0.001)(表1)。

表1 高原低氧对小鼠脾脏指数的影响值(±s)Table 1 The effects of high altitude hypoxia on the spleen index of mice(±s)

表1 高原低氧对小鼠脾脏指数的影响值(±s)Table 1 The effects of high altitude hypoxia on the spleen index of mice(±s)

指标 A组(n=10) C组(n=10) t P体重(g) 19.718±0.541 23.172±0.597 13.558 ＜0.001脾脏质量(g) 0.088±0.006 0.090±0.005 0.777 0.447脾脏指数(%) 0.449±0.037 0.390±0.026 4.161 ＜0.001

2.2 高原低氧减少小鼠脾脏T淋巴细胞数量

饲养30天后，A组小鼠脾脏 CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞数明显低于C组，且CD4+/CD8+T比值明显降低，即CD4+T细胞数目下降程度明显大于CD8+T细胞(P＜0.001，表 2，图 1);A 组小鼠脾脏CD4+CD28+T细胞数明显低于 C组(P＜0.001)，但两组小鼠脾脏CD8+CD28+T数无明显差异(P=0.080，表 2，图 1)。

表2 高原低氧对小鼠脾脏T淋巴细胞数量的影响值(±s)Table 2 The effects of high altitude hypoxia on the number of spleen T lymphocytes in mice(±s)

表2 高原低氧对小鼠脾脏T淋巴细胞数量的影响值(±s)Table 2 The effects of high altitude hypoxia on the number of spleen T lymphocytes in mice(±s)

指标 A组(n=10) C组(n=10) t P CD3+T(%) 28.009±3.735 41.585±4.766 7.091 ＜0.001 CD4+T(%) 13.973±1.309 25.161±0.751 23.445 ＜0.001 CD8+T(%) 12.490±0.508 17.788±0.616 20.987 ＜0.001 CD4+/CD8+T 1.119±0.089 1.416±0.067 8.440 ＜0.001 CD4+CD28+T(%) 52.180±0.841 62.994±1.508 19.808 ＜0.001 CD8+CD28+T(%) 30.431±0.081 31.190±1.027 1.859 0.080

图1 流式细胞仪检测脾脏T细胞亚群分布图Figure 1 Distribution of spleen T cell subsets detected by Flow cytometry

2.3 高原低氧抑制小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力

同等条件下细胞培养48 h后，在相同剂量ConA刺激下，A组小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力明显低于 C 组(P＜0.001，表 3)。

表3 高原低氧对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响结果(±s)Table 3 The effect of hypoxia on the proliferation of spleen T lymphocytes in mice(±s)

表3 高原低氧对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响结果(±s)Table 3 The effect of hypoxia on the proliferation of spleen T lymphocytes in mice(±s)

组别 n T细胞增殖(OD值) t P A C 10 0.202±0.049 10 0.319±0.045 5.603 ＜0.001

2.4 高原低氧对小鼠脾脏细胞分泌细胞因子存在不同影响

两组培养小鼠脾脏细胞上清液内IL－4含量无明显差异(P=0.677)，但A组培养小鼠脾脏细胞上清液内 IFN－γ含量明显低于 C组(P＜0.001)(表4)。

表4 高原低氧对小鼠脾脏细胞分泌细胞因子的影响(±s)Table 4 The effects of hypoxia on cytokine secretion of spleen cells in mice(±s)

表4 高原低氧对小鼠脾脏细胞分泌细胞因子的影响(±s)Table 4 The effects of hypoxia on cytokine secretion of spleen cells in mice(±s)

指标 A组(n=10) C组(n=10) t P IL－4 含量(mg/L) 200.700±29.963 195.700±22.236 0.424 0.677 IFN－γ 含量(mg/L) 298.000±27.060 435.500±39.039 9.154 ＜0.001

3 讨论

T淋巴细胞是免疫细胞中含量最多，且功能最复杂的一类细胞，常被分为三个亚群即辅助性T细胞(CD4+T)、抑制性T细胞(Ts)和细胞毒性T细胞(CD8+T)，CD4+T细胞是免疫反应的核心细胞，CD8+T细胞是效应细胞［3，4］。脾脏是 T淋巴细胞最主要的暂存外周免疫器官场所，脾脏的大小和生理功能在一定程度上可影响T淋巴细胞的数量和免疫功能［5］。本实验结果显示低氧组小鼠脾脏指数高于常氧对照组，但两组小鼠脾脏净重之间无明显差异。有研究表明低氧可通过减少内源性大麻素的表达量以及瘦素的分泌量，抑制大鼠的摄食量，进而出现体重降低的现象［6－8］。结合本实验结果，低氧可能是通过降低体重进而增加小鼠脾脏比例的。

本实验结果显示，低氧组小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力较常氧对照组低。有研究表明，低氧可促进T淋巴细胞的凋亡［9，10］。结合本实验结果，低氧可能是通过促进T淋巴细胞的凋亡过程以及抑制T淋巴细胞的增殖能力，进而减少脾脏T淋巴细胞的数量。CD4+T/CD8+T比值是映射机体免疫能力的指标，二者的比值发生改变会导致机体免疫系统紊乱，甚至出现自身免疫性疾病［11，12］。田云梅等［13］发现，模拟海拔8 000 m低氧环境暴露6天，小鼠脾脏淋巴细胞凋亡率和坏死率显著增加，且外周血及脾脏中CD8+T淋巴细胞变化不一，即出现细胞免疫功能紊乱的现象;而低氧组小鼠脾脏CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量明显低于常氧对照组，且CD4+T变化程度较CD8+T更为明显。结合本实验结果，低氧组出现CD4+T和CD8+T变化程度不一的现象可能与免疫功能紊乱有关。

按照CD28分子的表达情况，T细胞分为4类:CD4+CD28－、CD4+CD28+、CD8+CD28+和 CD8+CD28－。其中CD4+CD28+和CD8+CD28+T细胞依次是Th和CTL的主要细胞，二者的含量均会影响机体的免疫应答结果，抗原提呈细胞表面B7分子与T细胞表面CD28分子的结合是激活T细胞的重要途径［14］。本研究显示低氧组小鼠脾脏CD4+CD28+T细胞比例明显低于常氧对照组，而CD8+CD28+T细胞比例无明显差异，说明低氧可能主要通过减少CD4+CD28+T细胞的比例影响机体免疫应答。

IFN－γ由Th1细胞分泌，IL－4由 Th2细胞分泌，而Th1和Th2细胞均属于CD4+T细胞。有研究表明低氧可同时减少外周血中CD4+T细胞数及IFN－γ和IL－4的含量，即Th1细胞和Th2细胞免疫平衡在低氧条件下被破坏［15，16］。而本研究发现两组培养小鼠脾脏细胞的上清液中IL－4含量无明显差异，但低氧组IFN－γ含量明显低于常氧对照组，说明模拟5 000 m海拔低氧饲养小鼠30天时，低氧可能是主要通过减少CD4+T细胞中Th1细胞的数量，进而抑制淋巴细胞IFN－γ的分泌。

综上所述，本实验结果表明模拟海拔5 000 m高原低氧暴露30天可使小鼠脾脏T淋巴细胞的数量减少，T淋巴细胞的增殖能力减弱，且减少细胞因子IFN－γ的分泌，进而抑制小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫活性。