朱智勇，靳卫权，王银星，赵 振，马颖才，王亚平

(青海省人民医院消化内科，西宁810007)

高原心脏病是由急慢性低氧累及心脏所引起的一种特殊类型的心脏病，通常发生在海拔3 000 m以上。由于低氧性肺动脉高压，使右心负荷加重、右心功能障碍，进一步使心肌收缩力减弱，心输出量降低，严重可致右心衰竭［1］。目前国内外关于高原心脏病的防治研究逐渐增多，但均未形成统一共识，高原心脏病的发病率及死亡率仍较高。大量的研究证实，缺氧通过诱导心肌细胞凋亡，造成心肌细胞数量减少，是高原心脏病的主要发病原因［2］。但缺氧致心肌细胞凋亡损伤的相关机制不明。

自噬是广泛存在于真核细胞中的、进化上高度保守的一种通过降解和循环利用基质来维持细胞内环境稳态的溶酶体依赖性降解过程，在低氧、病原微生物入侵、缺血/再灌注等各种因素刺激下，细胞自噬活性显著升高［3－4］。研究发现自噬与心血管系统疾病的发生发展关系密切［5－6］，但心肌细胞自噬在心肌急慢性缺氧以及压力负荷过重等各种应激情况下的变化情况以及功能还不清楚，且缺乏急慢性低氧环境下的系统性观察研究。

因此，本研究通过检测大鼠心肌组织细胞自噬相关蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的表达水平，观察其在不同低氧时间下的变化趋势，揭示自噬在低氧性心肌细胞凋亡损伤中的作用及其机制，以期为高原心脏病发病机制的深入研究及新药的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组方法

选取6～8周龄的成年雄性Wistar大鼠60只(由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号:0003127)，由西安空运至西宁，随机分为对照组(n=10，西宁，2260米)与实验组(n=50，低压氧舱，5000米)，实验组大鼠迅速置于低压氧舱(模拟海拔5000米)，建立大鼠高原低氧环境暴露模型，根据低氧暴露时间不同，分为低氧 1、7、14、21、28 d 组，每组各10只，分别取各组大鼠右心室心肌组织，其中对照组在西宁取材，实验组在低压氧舱取材。

1.2 主要仪器及试剂

低压氧舱室(贵州风雷航空机械有限公司，型号:DYC－3000，体积:8m×3m×3m)，正置显微镜(徕卡显微系统有限公司)，石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司)，大鼠Beclin－1多克隆抗体(博士德生物有限公司，免疫组织化学检测工作浓度为1:200)，LC3－II多克隆抗体(美国Abcam有限公司，免疫组织化学检测工作浓度为1:200)。TRIzol RNA提取试剂盒(美国ambion公司)，逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国KAPA Biosystems公司)。目的基因Beclin－1、LC3－Ⅱ及内参基因β－actin引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 大鼠心肌组织大体形态

按不同时间点用25%乌拉坦行腹腔注射麻醉，开胸取各组大鼠右心室心肌组织，用生理盐水清洗干净，并将组织剪切为多个大小相近的小块，将一小块心肌组织固定于4%多聚甲醛溶液中，以各级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，并脱蜡，切片入苏木素中染色约10～30 min，分色，然后用0.5%伊红酒精液复染，HE染色结束后在光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织大体形态结构改变及组织细胞凋亡坏死情况，分析比较各组之间变化差异。

1.4 大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平

通过免疫组织化学染色法检测大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平。依次将石蜡切片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复、阻断，然后滴加一抗，湿盒孵育，室温下放置1 h，用PBS冲洗，滴加maxvision二抗，湿盒孵育，室温下放置20～30 min，用PBS冲洗、DAB染色，观察到切片有颜色改变时，用自来水洗去染色液、苏木素复染、1%盐酸酒精分化，显微镜下观察，控制染色程度，用自来水冲洗，放入65℃烘箱中烘干水分，将玻片置于二甲苯中透明，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15 min，最后通过显微镜拍照、Lecia Applaction Stiue图像系统采集分析样本相关部位，免疫组织化学染色所得图像采用Image－pro plus 6.0软件，使用平均光密度值(IDO)进行半定量分析。

1.5 大鼠心肌组织 Beclin－1、LC3－Ⅱ的 mRNA 表达水平

使用TRIzol RNA提取试剂盒提取大鼠心肌组织细胞总RNA，测定其浓度及质量，取2μg A260/A280为1.9～2.0的总RNA为逆转录模板，逆转录合成第一链cDNA用于real－time PCR实验。

采用Real－time PCR法检测大鼠心肌组织细胞Beclin－1及LC3－ⅠI的mRNA表达水平。引物序列如下，目的基因:LC3－ⅠI－rat f5'－AAGCACTACGGCTGCTCTTT－3'，LC3－ⅠI－rat r5'－CCCATTGCTGGAGTGCTGTA－3';Beclin－1－rat f5'－CACTCTGATCGGGGAGGCAT－3'，Beclin－1－rat r5'－TCCAACATCTCCAAACAGCGT－3';内参基因:β－actin－rat f5'－GGGGCTCTCTGCTCCTCCCTG－3'，β－actin－rat r5'－CCAGGCGTCCGATACGGCCA－3'。

PCR反应体系(20μL体系):2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，第一链 cDNA 1 μL，目的基因Beclin－1及LC3－ⅠI及内参基因 β－actin上、下游引物各5 mol(0.5μL)，用灭菌双蒸水补齐至 20 μL。实验在ABI7500荧光实时定量PCR仪中进行。目的基因与内参基因的PCR反应条件一致，95℃，3 min;95℃，5 sec;56 ℃，10 sec;72 ℃，25 sec，39 个循环，绘制熔解曲线，使用SYBR Green检测荧光改变，反应结束后根据获取的循环阈值(CT值)，采用相对定量法计算2－△△CT，分析数据，比较组间差异。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件，计量资料用珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织大体形态改变情况

用低压氧舱模拟5 000 m高海拔(严重低氧环境)构建大鼠心肌组织细胞损伤模型，各组大鼠心肌组织行HE染色。显微镜观察结果:对照组心肌结构正常，心肌细胞平行排列，核位于中央，胞内可见清楚的横纹;低氧1 d组肌纤维排列规则，少量炎细胞浸润，少量肌细胞细胞核固缩凋亡，余未见明显异常;低氧7 d组肌纤维排列紊乱疏松，大量肌纤维束断裂，肌细胞边界不清，大量肌细胞变性坏死;低氧14 d组肌纤维排列紊乱疏松，大量肌纤维束断裂，局灶可见炎细胞浸润，大量肌细胞凋亡坏死;低氧21 d组肌纤维排列紊乱疏松，大量肌纤维束断裂，局灶出现淤血，大量肌细胞凋亡坏死;低氧28 d组肌纤维排列紊乱疏松，大量肌纤维束断裂，少量炎细胞浸润，局灶可见淤血，大量肌细胞凋亡坏死。HE染色显示随着低氧暴露时间的逐渐延长，心肌组织细胞凋亡损伤逐渐加重(图1)。

图1 大鼠心肌组织HE染色图Figure 1 HE staining of myocardial tissue in rats

2.2 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平

采用免疫组织化学染色法检测各组大鼠心肌组织细胞Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平，使用IDO进行半定量分析。结果显示:与对照组相比，低氧1、7、14、21、28 d 组大鼠心肌组织 Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平均明显增加，并且随着低氧时间的延长而逐渐增加(均 P＜0.05)(图 2～3，表 1)。

图2 大鼠心肌组织Beclin－1免疫组化图Figure 2 Immunohistochemical results of Beclin－1 in myocardial tissue inrats

图3 大鼠心肌组织LC3－Ⅱ免疫组化图Figure 3 Immunohistochemical results of LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats

表1 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平(±s)Table 1 Protein expressions of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

表1 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表达水平(±s)Table 1 Protein expressions of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

*:与对照组比较，P＜0.05;△:与低氧 1 d 组比较，P＜0.05;#:与低氧7 d 组比较，P＜0.05;$:与低氧14 d 组比较，P＜0.05;＆:与低氧 21 d 组比较，P＜0.05.

组别 例数(n) Beclin－1 LC3－Ⅱ对照组 10 6913.09±772.05 3327.75±159.93低氧 1 d 10 9682.77±1742.41* 5288.94±853.48*低氧 7 d 10 14895.71±1422.17＊△ 8458.87±253.80＊△低氧 14 d 10 25277.73±2721.79＊△# 16248.86±901.55＊△#低氧 21 d 10 35169.90±1539.75＊△#$ 26055.75±742.34＊△#$低氧 28 d 10 42569.15±1289.34＊△#$＆ 30055.46±2413.24＊△#$＆F 290.88 373.96 P 0.000 0.000

2.3 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达水平

采用Real－time PCR法检测各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达水平。结果显示:低氧各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达变化与蛋白表达基本一致，与对照组相比，低氧1、7、14、21、28 d 组大鼠心肌组织 Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达水平均明显增加，并且随着低氧时间的延长而逐渐增加(均P＜0.05)(表2)。

表2 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达水平(±s)Table 2 mRNA levels of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

表2 各组大鼠心肌组织Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表达水平(±s)Table 2 mRNA levels of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

*:与对照组比较，P＜0.05;△:与低氧 1 d 组比较，P＜0.05;#:与低氧7 d 组比较，P＜0.05;$:与低氧14 d 组比较，P＜0.05;＆:与低氧 21 d 组比较，P＜0.05.

组别 例数(n) Beclin－1 LC3－Ⅱ对照组 10 1.59±0.22 1.05±0.35低氧 1 d 10 3.54±0.54*3.29±1.03*低氧 7 d 10 5.25±1.02＊△ 5.88±1.87＊△低氧 14 d 10 6.99±1.76＊△# 8.14±2.23＊△#低氧 21 d 10 8.68±2.19＊△#$ 10.42±3.08＊△#$低氧 28 d 10 10.34±3.05＊△#$＆ 12.71±3.85＊△#$＆F 34.26 33.91 P 0.000 0.000

3 讨论

本研究通过HE染色观察了不同低氧时间下大鼠心肌组织细胞凋亡损伤的变化，并分别检测了各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白及mRNA表达水平。结果显示，随着低氧暴露时间的逐渐延长，大鼠心肌组织细胞凋亡坏死数量逐渐增加，损伤程度逐渐加重，心肌组织中Beclin－1、LC3－Ⅱ的表达水平逐渐升高。国外离体细胞培养研究显示，随着缺氧刺激条件的持续存在，心肌细胞自噬增强导致心肌细胞凋亡损伤，心功能降低［7］，本研究结果与上述研究结果基本一致。

已知生理状况下自噬一般保持较低水平，在一些应激刺激因素作用下，组织细胞自噬活性可大大增加，发挥一定的保护作用［8，9］，但同时自噬程度过低或过度都是有害的，过多的自噬可加重组织细胞凋亡坏死，破坏组织器官正常功能的发挥［10］。低氧作为应激因素诱导机体组织细胞发生自噬变化，不同类型的细胞自噬对缺氧的反应不同，自噬可以诱导细胞存活，也可以诱导自噬性细胞死亡，相关报道认为轻度低氧下自噬促进细胞存活，而严重低氧下自噬能诱导细胞凋亡损伤［11］。研究发现心肌缺血再灌注阶段自噬水平增加可损伤心肌细胞，导致细胞凋亡，而干扰或抑制自噬相关基因Beclin－1的表达可以减少缺血再灌注后心肌细胞损伤［12］;严重缺血缺氧时，神经细胞可通过激活自噬而加重脑损伤，严重影响脑神经功能［13］;给予自噬诱导剂可加重急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织细胞损伤和炎症反应［14］;抑制自噬相关蛋白的表达可降低缺血再灌注肾小管上皮细胞的坏死程度［15］，抑制自噬也减少了同种异体肾移植缺血再灌注后凋亡坏死的肾小管上皮细胞数量［16］。这些均表明，持续严重的低氧可诱导自噬介导的组织细胞凋亡损伤。心肌细胞作为一种长寿命高度分化终末细胞，其分化再生能力非常有限，心肌细胞自噬在心肌缺血、缺氧以及压力负荷过重等各种应激下增强，但其在这些疾病下的具体作用还不清楚，总体认为在心脏疾病的发生发展中，细胞自噬的作用具有双重性，低水平的自噬能降解受损的细胞器，供给氨基酸和游离脂肪酸，进而保护细胞免于死亡［17，18］，但持久过度的自噬则会过度消耗必须蛋白质和正常细胞器，不利于细胞生存［19，20］。本研究结果发现，大鼠暴露在 5 000 m 严重低氧环境下，随着低氧时间的逐渐延长，心肌组织自噬相关蛋白的表达水平逐渐增加，而细胞凋亡损伤却逐渐加重，认为在严重低氧环境下，心肌组织细胞可通过增加自噬水平而加重细胞凋亡损伤，最终致心功能下降，促进高原性心脏病的发生发展。

综上所述，本研究结合低氧对组织细胞自噬的调节作用，系统观察了不同低氧时间下大鼠心肌组织细胞自噬相关蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的表达变化趋势，并揭示了自噬在低氧性心肌细胞凋亡损伤中的作用，为高原心脏病的防治提供了理论指导。但本研究只是对少数大鼠心肌组织细胞自噬相关蛋白表达水平的观察，缺乏电镜观察等更多有力证据，今后需扩大样本含量，多方面研究自噬在急慢性心肌凋亡损伤中的具体作用机制。