张 莹，文绍敦，童 丽，李永平

(青海大学，青海西宁810001)

已有证据表明，性激素分泌紊乱与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)在多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的发展进程中占有重要地位。其中，IR是PCOS重要的临床特征，约50%～70%的PCOS患者存在不同程度的IR［1］。其机制可能与胰岛素受体后信号传导障碍有关，尤其是磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphoinositide3－kinase，PI3K)介导的胰岛素信号通路(PI3K/Akt)［2］。中医认为，PCOS属肾、肝、脾三脏功能失调，从而引起肾－天癸－冲任－胞宫轴的异常。本研究应用针刺改善生殖功能障碍联合五子衍宗丸补肾治疗，观察对PCOS－IR模型大鼠生殖内分泌及PI3K/Akt信号通路的影响，探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级21日龄Wistar雌鼠32只，体质量(55±5)g，由甘肃兽医研究所实验动物中心提供［许可证号:SYXK(甘)2014－0002］，适应性饲养2天。随机分为空白对照组、模型组、二甲双胍组和针药联合组，每组8只。

1.2 实验药品、试剂和仪器

主要药品和试剂:脱氢表雄酮(DHEA，上海源叶生物科技有限公司)，注射用油(北亚试剂，国药准字H21024303)，二甲双胍(上海施贵宝，国药准字H20023370)，五子衍宗丸(北京同仁堂，国药准字Z11020188)。空腹胰岛素(FINS)ELISA试剂盒、卵泡刺激素(FSH)ELISA试剂盒、黄体生成素(LH)ELISA试剂盒、雌二醇(E2)ELISA试剂盒、睾酮(T)ELISA试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司)。反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(Takara)。引物(Qiagen)。

主要仪器:血糖仪(强生稳择易)，低温离心机(5424R，艾本德)，酶标仪(RT－6500，雷杜)，实时荧光定量PCR仪(LightCycler 96)。

1.3 模型制备方法［3］

根据Lee MT等的方法，除空白对照组外，其余大鼠项背部皮下注射 DHEA(6mg/100g体重，溶于0.2mL注射用油中)，连续注射20天，空白对照组同期项背部皮下注射注射用油(0.2mL)。注射第10天开始，取阴道涂片连续观察两个动情周期，以连续出现角化细胞判定为PCOS造模成功。将造模成功的PCOS大鼠于当晚8时禁食，次晨8时眶静脉取血做空腹血糖(FPG)和 FINS检测。计算HOMA－IR，HOMA－IR=FPG(mmol/L)× FINS(mU/L)/22.5。实验中将HOMA－IR＞2.8的PCOS大鼠作为成功模型。

1.4 各组处理方法

除空白对照组外，其余各组大鼠为防止自身恢复排卵，在治疗的同时每日于皮下注射溶于注射用油的DHEA(剂量同上)。二甲双胍组给予二甲双胍溶液(0.012g/mL)灌胃;针药联合组首先针刺治疗，根据中国针灸学会分会制定的“动物针灸穴位图谱”选用双侧“肾俞”“胰俞”“关元”“子宫”“三阴交”“丰隆”穴，直刺3～5 mm，提插捻转强刺激并留针5分钟后出针;然后给予五子衍宗丸溶液(0.14g/mL)灌胃，连续 28 天。

1.5 标本采集和储存方法

末次治疗当晚禁食(水)12小时，次晨8时尾静脉采血测FPG，然后以10%水合氯醛(0.35mL/100g)行腹腔注射麻醉，于腹主动脉采血离心(3000r/min)15分钟，分离血清，－20℃保存备用;分离两侧卵巢，一侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定，另一侧卵巢以液氮速冻，－80℃保存备用。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 卵巢形态学的检查

各组大鼠取一侧卵巢，予4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片(5μm)，常规脱蜡、染色、脱水、透明、封片，置显微镜下观察。

1.6.2 性激素及胰岛素抵抗指数的测定

血清标本采集后，采用ELISA法测定FINS、FSH、LH、E2和T，并计算HOMA－IR。严格按照试剂盒说明书操作。标准品孔加50μL不同浓度的标准品，样本孔加待测样本40μL，再加10μL样本稀释液，除空白孔外每孔加入酶标试剂100μL，封板温育(37℃)1小时;稀释洗涤液，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去拍干，反复5次;每孔加底物A和B各50μL，避光温育(37℃)15分钟，加终止液50μL，在450 nm波长处测定各孔吸光度，计算样本浓度。

1.6.3 卵巢组织 IRS－1、PI3K mRNA 的表达测定

采用实时荧光定量PCR技术检测卵巢组织IRS－1、PI3K mRNA的表达。标本在液氮中研磨，用Trizol法提取组织RNA，反转录成cDNA，以LightCycler96系统行实时荧光定量，引物序列见表1，反应体系如下:SYBR Green mix 10.0 μL，引物 0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，水 7.2 μL。扩增反应程序:95℃，5 s;60℃，30 s，40个循环。将待测基因与内参β－actin的比值作为待测基因mRNA的相对表达量，结果采用 2－ΔΔCt计算。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for Real－time PCR

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件，计量资料数据采用珋x±s表示，组间采用单因素方差分析，多重两两比较方差齐时采用 LSD－t检验，方差不齐时采用Tamhane's T2检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢病理切片图(图1)

图1显示，空白对照组大鼠卵巢可见不同发育阶段的卵泡;模型组卵巢呈多囊样改变，闭锁卵泡增多，直径较大，且未见黄体分布;二甲双胍组和针药联合组可见不同发育阶段的卵泡及少数黄体。

图1 各组大鼠卵巢HE染色病理图(HE×10)Figure 1 Pathological status of the ovary in each group(HE×10)

2.2 各组间性激素水平(表2)

表2显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清FSH和E2水平明显降低(P＜0.01)，LH和T水平显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，二甲双胍组和针药联合组血清FSH和E2水平升高(P＜0.01)，LH和T水平降低(P＜0.01)。各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠性激素水平比较表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

表2 各组大鼠性激素水平比较表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

*:与空白对照组比较，P＜0.01;#:与模型组比较，P＜0.01.

组别 n FSH(IU/L)LH(mIU/mL)E2T(pmol/L)(pg/mL)空白对照组 8 3.61±1.18 11.22±4.50 24.62±4.19 17.44±2.87模型组 8 1.08±0.44* 18.24±4.85* 6.02±1.17* 95.55±17.05*二甲双胍组 8 2.88±0.44# 12.47±2.12# 19.66±2.60# 18.07±2.34#针药联合组 8 3.38±0.41# 11.24±2.72# 24.19±3.60# 20.28±1.52#F 21.756 6.465 62.594 154.543 P 0.000 0.002 0.000 0.000

2.3 各组间胰岛素抵抗指数(表3)

表3显示，与空白对照组比较，模型组大鼠FINS水平及 HOMA－IR 值明显升高(P＜0.01)，FPG值稍高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型组比较，二甲双胍组和针药联合组FPG降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，FINS水平及 HOMA－IR 值降低(P＜0.01)，各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 各组大鼠胰岛素抵抗情况比较表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

表3 各组大鼠胰岛素抵抗情况比较表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

*:与空白对照组比较，P＜0.01;#:与模型组比较，P＜0.01.

组别 n FPG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA－IR空白对照组 8 4.20±0.76 16.24±3.55 3.03±0.77模型组 8 4.85±0.26 48.19±8.26* 10.41±2.06*二甲双胍组 8 4.34±0.92 22.39±4.30# 4.44±1.83#针药联合组 8 4.09±0.51 17.71±6.02# 3.29±1.43#F 2.077 52.668 37.608 P 0.126 0.000 0.000

2.4 各组大鼠卵巢组织IRS－1、PI3K mRNA表达水平(表4)

表4显示，与空白对照组比较，模型组大鼠卵巢组织中IRS－1、PI3K mRNA下降，说明胰岛素信号通路受到抑制。与模型组比较，二甲双胍组和针药联合组 IRS－1、PI3K mRNA 显著上调(P＜0.01)。各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表4 各组大鼠卵巢组织IRS－1、PI3K mRNA表达情况(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

表4 各组大鼠卵巢组织IRS－1、PI3K mRNA表达情况(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

#:与模型组比较，P＜0.01.

组别 n IRS－1 mRNA PI3K mRNA空白对照组 8 1.06±0.33 1.04±0.35模型组 8 0.75±0.39 0.82±0.25二甲双胍组 8 3.10±0.75# 1.97±0.58#针药联合组 8 3.47±1.41# 1.70±0.48#F 22.133 12.402 P 0.000 0.000

3 讨论

IR是PCOS的重要临床特征，过量的胰岛素通过神经－内分泌－免疫网络的下丘脑－垂体－卵巢轴在垂体水平促进LH的分泌，使雄激素的合成和分泌增加，结果将直接导致胰岛素和雄激素同时作用于肝脏抑制性激素结合球蛋白的分泌，导致血清T和E2水平增高［4］。但本实验E2水平降低，可能原因是DHEA为外源性雄激素，注射入体内使雄激素升高，但难以区分内源性和外源性，影响其转换为雌激素，故E2水平降低［5］。雌激素又同时对FSH分泌呈负反馈作用，使FSH水平相对降低，从而形成雄激素过多、持续无排卵，最终导致卵巢多囊样改变［6－7］。研究表明雄激素能抑制 PI3K/Akt信号通路的传导，从而引起IR［8］。综上所述，雄激素作为中间环节，可使生殖内分泌发生变化及PI3K/Akt通路被抑制，本实验采用DHEA项背部皮下注射的方法诱导PCOS－IR模型大鼠，模拟雄激素过多及排卵障碍的病症。

从传统医学的角度，PCOS当属肾、肝、脾功能失调，痰湿、瘀血等病理因素相互错杂，且虚实夹杂的病症［9－11］。肾－天癸－冲任－胞宫中医生殖轴的异常致本病的发生。因此，本研究针灸治疗选择补肾益精，疏通任脉之气为主，穴位选择根据肾－天癸－冲任－胞宫轴，选用肾俞穴以补肾益精，关元穴调理冲任，局部选穴选择治疗妇科疾病经验要穴(子宫穴);根据PCOS病因病机选取肾肝脾三经交会穴三阴交调理三脏，丰隆穴祛湿化痰，最后选用胰腧穴针对胰岛素抵抗。五子衍宗丸作为古今“种子第一方”则主要以补肾为主，方中菟丝子、枸杞子为君药补肾益精，滋补肝脾;覆盆子、五味子为臣药补肾养肝，涩精止遗;车前子为佐药利水祛痰，五药共奏具有补肾益精的作用［12］。近年来，五子衍宗丸多用于男性生殖系统疾病。但有研究表明，在治疗女性生殖系统疾病方面该药具有类性激素作用，因而可以调节女性更年期症状，治疗女性不孕等［13］。实验结果显示针药联合治疗后，大鼠血清性激素FSH和E2水平明显升高，LH和T水平明显下降，FINS水平及HOMA－IR 值明显下降，IRS－1、PI3K mRNA 水平显著上调，且与二甲双胍组差异无统计学意义，说明针刺联合五子衍宗丸可以更好改善生殖内分泌水平及IR情况。

综上所述，针药联合治疗PCOS－IR模型大鼠疗效显著，其机制可能是通过改善下丘脑垂体卵巢轴以恢复排卵，通过上调PI3K/Akt信号通路以改善IR。但是，对整个PI3K/Akt信号通路的影响，还有待进一步研究证明。