廖梦姣，侯立朝，王志鑫，汤 锋，王东旭，任 利，庞明泉，王海久，樊海宁*

(1.青海大学附属医院肝胆外科，青海 西宁 810001；2.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001；3.青海省包虫病重点实验室，青海 西宁 810001)

Treg细胞参与维持机体的免疫平衡，具有免疫负向调控作用[1-3]，Foxp3是Treg细胞的标记物，但Foxp3是细胞核蛋白，限定了Treg细胞的分离，也阻碍了对Treg细胞功能的进一步研究[4]，在胃肠道疾病中发现CD127也是Treg细胞的表面标记物，其CD127在CD4+的细胞中呈高表达(CD4+CD127high)。但在CD4+CD25high的细胞中CD127呈低表达(即CD4+CD25+CD127low)，在CD4+CD25highCD127lowTreg细胞中检测到大于90%的细胞表达Foxp3，并且CD4+CD25+CD127lowTreg细胞能抑制T细胞的增值和功能[5]，相关文献报道过Treg细胞在泡型包虫病中发挥作用[6]。但在泡型包虫病中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞是否表达Foxp3，及其在泡型包虫病的发展过程中存在何种意义，是否和CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞一样在泡球蚴感染中发挥免疫抑制作用，现有文献未做阐述。本研究拟探讨CD4+CD25+CD127lowTreg细胞中Foxp3的表达及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在泡球蚴感染中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级BALB/c雄性小鼠18只，体重(20±2)g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场[许可证号：SCXK(苏)2017-0001，NO.201722769]，随机分成泡型包虫病组、健康对照组。

1.1.2 实验试剂、仪器

小鼠IFN-γ、IL-10、TGF-β1 ELISA试剂盒(Abcam公司)。抗体FITC Rat Anti-mouseCD4、PE Rat Anti-mouseCD25、APC Rat Anti-mouse CD127、BV421 Rat Anti-mouse Foxp3，同型对照FITCRat IgG2a、PE Rat IgG1、APC Rat IgG2b、BV421 Rat IgG2b，破膜液FIX/PERM(BD Biosciences公司)。小鼠淋巴细胞分离液(CEDARLANE公司)。青霉素-链霉素混合液(Gibco公司)。

5810R型离心机(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 泡型包虫病小鼠动物模型的建立

从感染泡球蚴的沙鼠腹腔中，在无菌条件下采集含泡球蚴的囊块，在生理盐水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL链霉素)中剪碎后，用300 μm的滤网过滤，收集下方的滤液，再用40 μm的滤网过滤，收集滤网上的泡球蚴，用生理盐水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL链霉素)清洗数次，泡球蚴的成活率占95%以上(镜下观察)。

泡型包虫病组(9只)：小鼠腹腔注射泡球蚴(生理盐水将原头蚴配成20%的浓度)200 μL。

健康对照组(9只)：小鼠腹腔注射生理盐水200 μL。

1.2.2 CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞的检测

动物模型建立3个月后，分别取泡型包虫病组与健康对照组脾脏研磨，提取淋巴细胞，制成细胞悬液，将100 μL细胞悬液加入流式管，再加入FITC Rat Anti-mouse CD4 4 μL、PE Rat Anti-mouse CD25 10 μL、APC Rat Anti-mouse CD127 5 μL避光孵育20 min，同型对照加FITC Rat IgG2a 5 μL、PE Rat IgG1 5 μL、APCRat IgG2b 5 μL避光孵育20 min，加入破膜液FIX/PERM 500 μL 避光孵育30 min，离心(400g)5 min，弃上清液，加入1×Wash buffer 1 mL清洗，再次离心(400g)5 min，弃上清液，加入胞内抗体BV421 Rat Anti-mouse Foxp3 5 μL，同型对照加BV421 Rat IgG2b 5 μL避光孵育30 min，离心(400g)5 min，弃上清液，加入1×Wash buffer 500 μL上流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg及CD4+CD25+CD127lowTreg细胞中Foxp3的含量。

1.2.3 细胞因子的检测

眼球采血收集小鼠血液，静置4 h，离心(2500g)20 min，收集血清，用ELISA法测定泡型包虫病组、健康对照组血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1水平。

1.2.4 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，组间均数比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 泡型包虫病组病灶大小

将泡型包虫病组小鼠处死，取出病灶测量大小，为(1.05±0.58)g。

2.2 健康对照组与泡型包虫病组CD4+CD25+CD127low Treg、CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞的含量

将小鼠脾脏研磨提取淋巴细胞后加入抗体上流式细胞仪检测，健康对照组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞为9.04±2.78，泡型包虫病组为14.91±4.21(P<0.004 V.S.健康对照组)，健康对照组CD4+CD25+Foxp3Treg细胞为0.76±0.73，泡型包虫病组为4.21±2.08(P<0.000V.S.健康对照组)(表1，图1)。

表1健康对照组与泡型包虫病组中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg细胞的含量

Table 1 The content of CD4+CD25+CD127low Treg and CD4+CD25+Foxp3 Treg in the control group andalveolar echinocococosis group

A为健康对照组，B为泡型包虫病组，C为健康对照组，D为泡型包虫病组

图1健康对照组与泡型包虫病组中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg细胞含量图

Figure1ThecontentofCD4+CD25+CD127lowTregandCD4+CD25+Foxp3Tregincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.3 CD4+CD25+CD127low Treg细胞中Foxp3的表达量

健康对照组与泡型包虫病组脾淋巴细胞在P3门下检测CD4+CD25+CD127lowTreg细胞中Foxp3的含量(图1)，健康对照组中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞中Foxp3的含量为70.7%，泡型包虫病组为67.7%，泡型包虫病组与健康对照组中CD4+CD25+CD127lowTreg高表达Foxp3(图2)。

A：健康对照组 B：实验组

图2健康对照组与泡型包虫病组中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞中Foxp3的含量图

Figure2Foxp3contentinCD4+CD25+CD127lowTregsincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.4 泡型包虫病组CD4+CD25+CD127low Treg细胞与病灶大小的相关性

泡型包虫病组中脾淋巴细胞CD4+CD25+CD127lowTreg的含量与病灶大小进行Pearson相关性分析，两指标呈正相关，r=0.894，P=0.01(图3)。

图3实验组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞与病灶大小相关性分析图

Figure3CorrelationAnalysisbetweencontentofCD4+CD25+CD127lowTregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisgroup

2.5 泡型包虫病组CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞与病灶大小的相关性

泡型包虫病组中脾淋巴细胞CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞的含量与病灶大小进行Pearson相关性分析，两指标呈正相关，r=0.714，P=0.031(图4)。

图4实验组CD4+CD25+Foxp3Treg细胞含量与病灶大小相关性分析图

Figure4CorrelationanalysisbetweencontentofCD4+CD25+Foxp3TregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisGroup

2.6 健康对照组与泡型包虫病组血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表达水平

健康对照组与泡型包虫病组小鼠分别进行眼球采血，离心(2500g，20min)取血清行ELISA检测，健康对照组IFN-γ为8.39±0.82，泡型包虫病组为560.95±123.71(P<0.000V.S.健康对照组)。健康对照组IL-10为 538.52±55.82，泡型包虫病组为1946.80±260.89(P<0.000V.S.健康对照组)。健康对照组TGF-β1为 223.90±56.34，泡型包虫病组为 321.35±36.44(P<0.001V.S.健康对照组)(表2)。

表2泡型包虫病组与健康对照组血清中IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表达水平

Table 2 The levels of IFN-γ、IL-10、TGF-β1 in serum in alveolar echinocococosis group and control group

3 讨论

本研究通过采用泡球蚴感染小鼠的动物模型观察CD4+CD25+CD127lowTreg细胞对Foxp3的表达及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在感染泡球蚴小鼠中作用机制，结果发现泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞增殖，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞高表达Foxp3，CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞能促进泡型包虫病的发展。

近几年对Treg细胞的鉴别及特异性标记物一直都有争议，活化标记物CD25不仅仅表达在Treg细胞上，也表达在活化的T细胞上。因此，不能通过CD25从活化的T细胞中区分出Treg细胞，CD25和Treg细胞的其他标记物如GITR、CTLA-4和CD45RB并不是在所有活化的CD4+细胞上都有表达[7-8]，近几年Foxp3作为Treg的标记物。但其是核内蛋白，限定了Treg细胞的体外分离及其进一步的功能研究，在胃肠道疾病中研究发现，通过表面标记物CD127联合CD4+CD25+分离的CD4+CD25+CD127lowTreg细胞高表达Foxp3。并具有免疫抑制作用，其可作为Treg细胞的表面标记物[9]。本研究以小鼠动物模型为载体，观察CD4+CD25+CD127lowTreg对Foxp3的表达，结果显示，不管是健康小鼠还是泡型包虫病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg细胞都高表达Foxp3，证实CD4+CD25+CD127lowTreg细胞在泡型包虫病中也可作为Treg细胞的表面标记物。

Treg细胞可通过细胞间的接触和分泌细胞因子发挥免疫调节作用，通过与效应性T细胞(Teff)的表面配体细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)、可诱导共刺激因子(ICOS)和程序性死亡分子1(PD-1)结合，抑制Teff的功能[10]，从而降低机体的免疫功能。Treg细胞还可分泌TGF-β1、IL-10来发挥免疫抑制作用，TGF-β1抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和Th1、Th2细胞的分化，同时促进外周Treg、Th17、Th9、Tfh细胞产生[11]。而白细胞介素(IL)-10是抑制抗原呈递和促炎细胞因子释放的调节性细胞因子[12]，我们实验显示泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞增殖，同时显示Treg细胞分泌的细胞因子(IFN-γ、IL-10和TGF-β1)显著升高、CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞含量与病灶的大小呈正相关。

综上所述，我们可以初步推测：泡型包虫病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg细胞高表达Foxp3，在泡型包虫病中可作为Treg细胞的表面标记物；CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞能促进泡型包虫病的发展，同时初步揭示CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg细胞在泡型包虫病的作用机制可能与抑制机体的免疫功能有关。

本实验的样本量少，并且机体免疫包括非特异性免疫和特异性免疫，它们之间并非孤立存在，而是存在密切的联系。因此，对于泡型包虫病的发病机制的研究，需要大量的、更深入的研究去阐明。