史友权 崇杨 汤东 熊清泉,4 黄玉琴,5 周怀成 张琪 金芝祥,5王道荣

近年来结直肠癌发病率愈来愈高，在全球肿瘤中发病率位于第三位，致死率位于第二位［1］。有研究认为 sFRP2（Secreted Frizzled-related proteins 2）表达减少或消失，导致与Wnt蛋白竞争性结合减少，Wnt/β-catenin通路被激活，β-catenin异常表达从而促进结直肠癌的发生发展［2-3］。目前关于sFRP2对结直肠癌细胞株HCT116细胞的增殖、迁移、侵袭等研究鲜见相关报道。我们检测了正常结直肠黏膜组织和结直肠癌组织中sFRP2和β-catenin的表达，以及在结直肠癌细胞株HCT116转染上调sFRP2后，对比转染前后细胞增殖、迁移和侵袭方面的变化，以探讨sFRP2和Wnt/β-catenin通路在结直肠癌发生发展中的作用。

材料与方法

一、材料

1.细胞和组织：结直肠癌细胞株HCT116来源于江苏省苏北人民医院实验中心。谷歌生物科技有限公司帮助构建包含sFRP2蛋白全长的pcDNA3.1质粒。结直肠组织标本来源于江苏省苏北人民医院2015～2017年手术切除或内镜活检确诊的标本，正常结直肠黏膜标本32例（非结直肠癌患者），结直肠癌标本32例，共64例，所有结直肠癌患者术前均未行放化疗，临床病理特征详见表1。

2.主要试剂：兔抗人sFRP2多克隆抗体（Abcam）、兔抗人β-catenin抗体（Santa Cruz）、免疫组化试剂盒（凯基生物）、胰蛋白酶（凯基生物）、Western Blot试剂盒（凯基生物）、CCK-8试剂盒（Dojindo）、胎牛血清（杭州四季青）、DMEM培养基（Hyclone）、脂质体Lipofectamine TM3000（Invitrogen）、Transwell小室（Corning Corstart）和Matrigel基质胶（BD）。

二、实验方法

1.免疫组化（SP）：选取上述结直肠组织标本，经福尔马林固定，脱水，石蜡包埋后切片。依次使用二甲苯常规脱蜡、酒精梯度复水和抗原修复后，根据免疫组化试剂盒说明书进行后续实验。每批均设置阴性和阳性对照，阴性对照：PBS替代一抗，阳性对照：已确定的sFRP2、β-catenin表达阳性的结直肠组织。

我们根据以下标准判定sFRP2和β-catenin的染色情况：（1）sFRP2染色结果根据染色强弱和细胞阳性表达率进行综合评分。1）染色强弱：0分（无染色），1分（淡黄色），2分（棕黄色），3分（棕褐色）。2）细胞的阳性表达率：0分（≤25%），1分（26%至50%），2分（51%至75%），3分（大于76%）。综合两者进行评分，依据评分判定结果，阳性（＋）：两项评分之和大于3；阴性（-）：两项评分之和小于等于3分。（2）β-catenin：细胞出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。膜正常表达：细胞膜染色程度大于70%；膜表达缺失：小于等于70%；胞浆或胞核阳性表达：胞浆或胞核阳性率在同类细胞中比例大于10%，两者都称为异位表达。异位表达和膜表达缺失统称异常表达［4］。

表1 sFRP2和β-catenin与结直肠癌临床特点的关系（例）

2.细胞培养及转染方法：培养条件为含10%胎牛血清的DMEM培养基＋培养箱（37℃和5%CO2）。使用LipofectamineTM3000转染试剂在细胞对数生长期转染pcDNA3.1质粒。实验分为3组：（1）对照组：未转染。（2）空载质粒组：转染空白质粒。（3）sFRP2转染组。转染过程依据转染试剂说明书进行。

3.Western blot：细胞经过处理后，加入RIPA裂解缓冲液。首先使用SDS/PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品，将其转移到PVDF膜上，配备5%脱脂奶粉封闭液，将PVDF膜上浸泡1 h，依次与兔抗人sFRP2多克隆抗体（1:1000）和兔二抗（1:1000）反应，后进行曝光显影。

4.CCK-8实验：将1.0×104个细胞接种于96孔板，根据CCK-8试剂盒产品说明书进行细胞计数。简而言之，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，并将它们孵育1 h，然后在450 nm下测量吸光度，实验重复3次。

5.划痕实验：将HCT116细胞接种于6孔板中，融合至80%～90%时，在孔板中心轴处用枪头沿直线轻轻划痕，然后用PBS除去细胞碎片。无血清培养基培养，在0 h、48 h进行观察拍照。测量划痕间的距离，实验重复3次。

6.Transwell实验：Transwell小室底部膜由Matrigel基质胶包被（滤膜孔径为8 μm）。上室：无血清DMEM培养基（含细胞），下室：10%胎牛血清DMEM培养基，孵育24 h。除去上室细胞后，用多聚甲醛中固定15 min，染色20 min。随机选取5个视野（100倍）进行细胞计数，取其平均值。

三、统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件。t检验应用于计量资料，χ2检验或Fisher精准检验应用于计数资料，Spearman分析用于检验相关性。组间比较选用独立样本t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、免疫组化

1.sFRP2和β-catenin在结直肠组织中的表达：我们分别对正常结直肠黏膜组织和癌组织两组进行了免疫组化检测，正常结直肠黏膜组织中sFRP2主要在细胞质里表达（图1A），β-catenin主要在细胞膜上表达（图1C）。结直肠癌组织中sFRP2低表达或不表达（图1B）。而β-catenin异常表达增加（图1D）。两组在sFRP2的阳性率、β-catenin膜表达缺失率及异位表达率等方面表达差异具有统计学意义（P＜0.01），正常黏膜组织中sFRP2的阳性率显著高于结直肠癌组，结直肠癌组中β-catenin膜表达缺失率和异位表达率癌显著高于正常结直肠黏膜组。详见表2。

2.sFRP2和β-catenin与结直肠癌临床特点的关系：如表1所示，sFRP2阳性表达、β-catenin膜表达缺失、异位表达与肿瘤组织分化存在明显差异（χ2=5.420，P=0.020；χ2=6.472，P=0.011；χ2=7.158，P=0.007），而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移无关（P＞0.05）。

3. 相关性分析：通过Spearman分析，我们研究发现sFRP2表达分别与β-catenin膜表达缺失（r=-0.39，P=0.03）及β-catenin异位表达（r=-0.47，P=0.01）负相关，β-catenin异位表达与β-catenin膜表达缺失正相关（r=0.50，P=0.004），且相关性均显著。详见表3。

二、Western blot检测

Western blot结果验证了转染后sFRP2的表达水平显著高于转染前（t=25.430，P=0.001），β-catenin表 达 水 平 亦 较 前 提 高（t=15.000，P=0.001），β-actin作为内参。如图2所示。

三、CCK-8实验

通过CCK-8方法检测发现，sFRP2转染组分别与对照组和空载质粒组比较［12 h：（t=0.016,P=0.988）和（t=0.041，P=0.970），24 h：（t=0.155,P=0.884）和（t=0.452，P=0.675），36 h：（t=0.695,P=0.525）和（t=1.173，P=0.306），48 h：（t=1.254,P=0.278）和（t=1.693，P=0.166），60 h：（t=3.440,P=0.026）和（t=3.576，P=0.023）］，细胞增殖速度明显减慢（图3），说明sFRP2抑制了结直肠癌细胞HCT116的增殖。

四、划痕实验

通过比较sFRP2转染组、空载质粒组和对照组三组HCT116细胞划痕两侧直线间的距离，来判断sFRP2对HCT116细胞迁移能力的影响。结果发现：sFRP2转染组划痕两侧距离与空白组、空载质粒组比较，迁移速度明显较慢［（t=16.890，P=0.001）和（t=7.206，P=0.002）］，表明sFRP2抑制了癌细胞的迁移。如图4所示。

五、Transwell实验

通过Transwell实验我们发现，对照组透膜（195.39±8.68）个，sFRP2转染组透膜（75.69±7.19）个，对照组透膜细胞数明显多于sFRP2转染组（t=25.459，P=0.001），如图5所示。

讨 论

图1 sFRP2和β-catenin在结直肠组织中的的表达。1A：正常结肠组织（sFRP2）；1B：结直肠癌组（sFRP2）；1C：正常结肠组织（β-catenin）；1D：结直肠癌组（β-catenin）（免疫组化SP法×400）

表2 sFRP2及β-catenin在两组中的表达情况［例（%）］

表3 结直肠癌中sFRP2和β-catenin表达的相关性（例）

图2 转染前后HCT116细胞中sFRP2、β-catenin的表达（sFRP2及β-catenin转染前后相比*P＜0.05）

sFRP2是sFRP家族7个成员之一，结构上与卷曲蛋白相似，均含有半胱氨酸富集区（cysteine rich domain，CRD）。一方面，sFRP2通过CRD与Frizzed竞争结合到Wnt蛋白上抑制Wnt通路；另一方面，sFRP2与Frizzed结合生成无功能的复合物，封闭Wnt信号通路［5］，从而抑制肿瘤的发生。当sFRP2表达减少时，与Wnt蛋白竞争性结合减少，不能阻断或封闭Wnt通路，导致Wnt通路激活，便起到了促癌的作用［6-7］。我们研究发现sFRP2在正常结直肠黏膜组中的阳性表达率（100%）显著大于结直肠癌组（28.1%），差异具有统计学意义（P＜0.05），这与刘宁等［8］研究结果相一致。有研究报道结直肠癌中sFRP2甲基化，可导致sFRP2表达水平下降或沉默［9-11］。

图3 sFRP2对结直肠癌HCT116细胞生长曲线的影响（sFRP2转染组与对照组相比*P＜0.05）

图4 sFRP2对结直肠癌细胞HCT116细胞迁移能力的影响（sFRP2转染组与对照组相比*P＜0.05）

Wnt是分泌型、脂质修饰的糖蛋白，其在胚胎发育过程中具有许多关键作用，并促进成年人的组织平衡。它们可以调节细胞的分化、增殖、迁移、存活和干细胞自我更新［12-14］。异常Wnt信号与许多疾病相关，特别是癌症［15］。Wnt/β-catenin通路是目前结直肠癌发生进展机制研究的热点［16］，当Wnt通路激活时，β-catenin不被降解，进入细胞核并积聚，β-catenin出现膜表达缺失和异位表达，与转录因子相互作用，启动转录，调控基因表达，从而促进肿瘤的发生和发展［17］。我们研究发现：β-catenin膜表达缺失率在结直肠癌组（53.7%）显著大于正常结直肠黏膜（0%），β-catenin异位表达率在结直肠癌组（61.1%）显著大于正常结直肠黏膜（0%），且差异具有统计学意义（P＜0.05）。这与相关研究［8］结果相一致。

图5 sFRP2对结直肠癌细胞HCT116细胞侵袭能力的影响（sFRP2转染组与对照组相比*P＜0.05）

本研究发现sFRP2的表达和β-catenin异常表达均与组织分化明显相关（P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分期及淋巴结转移无关（P＞0.05），这与相关研究［8，18-19］结果相一致。我们通过检测发现，发现sFRP2的阳性率与β-catenin的膜表达缺失率及异位表达率均呈负相关，β-catenin的膜表达缺失率和异位表达率呈正相关，与刘宁等［8］和潘世杰［20］相关研究报道一致。主要因为sFRP2的表达减少，导致Wnt通路激活，从而引起β-catenin表达的变化。

目前，在结直肠癌细胞株HCT116中转染上调sFRP2后研究其对细胞的增殖、迁移和侵袭的研究尚缺乏。我们研究发现sFRP2上调后细胞增殖速度显著减慢，抑制HCT116细胞的增殖。肖灿［21］通过质粒转染上调人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞中sFRP2的表达，发现sFRP2的过表达显著抑制了细胞的增殖。sFRP2表达水平下降导致Wnt/β-catenin通路的激活，进而β-catenin进入胞浆和胞核并积累，与CyclinD1启动子中的LEF-1位点相互作用，激活转录过程，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）被激活后，诱导磷酸化，促进基因转录，促使细胞完成由G1期到S期的转换，并进入增殖期［22-23］。所以sFRP2表达水平升高阻断或封闭Wnt/β-catenin通路，则抑制了细胞的增殖［24］。通过划痕实验，我们发现sFRP2抑制了细胞的迁移能力。通过Transwell实验我们发现sFRP2转染组透膜细胞数明显小于对照组透膜细胞数，说明sFRP2抑制HCT116细胞的侵袭能力。但是我们的实验细胞比较单一，仅一种结直肠癌细胞，仍需要进一步在其他结直肠癌细胞中进行验证。

综上所述，sFRP2是一种抑癌基因，通过调控Wnt/β-catenin通路而发挥其作用。sFRP2结直肠癌细胞株HCT116中转染上调后，明显抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。希望本研究能为结直肠癌的治疗提供新的靶点和思路。