张瀚丹，吴道勋，张海珠 ，李 杨

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；3.大理大学学报编辑部，云南大理 671003）

肺纤维化是一种肺功能进行性丧失的严重的呼吸系统疾病，常出现干咳、呼吸困难等症状，随着患病时间增加，患者的呼吸功能不断恶化，患者的生存时间仅为2.8年，其死亡率高于大多数肿瘤〔1〕，引起医护人员的广泛关注。成纤维细胞异常增殖在肺纤维化形成过程中起重要作用〔2〕，肺成纤维细胞异常增殖后转化为肌成纤维细胞，两者分泌大量的细胞外基质，形成肺纤维化。在肺纤维化过程中，大量的肺泡塌陷而形成密集的疤痕，最终导致肺结构破坏，引起严重的呼吸困难。目前，临床上常使用抗炎药物与免疫抑制剂治疗肺纤维化，但其并不能有效地抑制肺纤维化，并且增加了肺部的感染几率，诱发呼吸衰竭〔3〕。因此，筛选安全、有效的抗肺纤维化药物迫在眉睫。

喙尾琵琶甲（Blaps rynchopeteraFairmaire）属鞘翅目（Coleoptera）拟步甲科（Tenebrionidae）琵琶甲属（Blaps），是云南民间历史悠久的药用昆虫，俗称为臭屁虫、臭壳子、咪多领等，具有良好的抗菌消炎、提高免疫功能以及抗肿瘤的功效〔4-7〕。云南彝族民间常用其治疗发烧、咳嗽、胃炎、疔疮、肿瘤等疑难杂症〔4〕；傣族地区认为其具有清热解毒、软坚散结、消肿止痛的功效，可用于消除瘢痕〔5〕。瘢痕是由皮肤纤维母细胞增殖及凋亡平衡失调所导致的疾病〔8〕，赵文斌等〔9〕研究表明喙尾琵琶甲能有效地减少成纤维细胞，抑制兔耳增生性瘢痕，这与抑制成纤维细胞异常增殖而减轻肺纤维化相类似。目前的研究认为，活化的肺成纤维细胞是肺纤维化中的关键效应细胞〔10〕，抑制肺成纤维细胞的增殖是治疗肺纤维化的关键步骤〔2〕，因此，研究开发抑制肺成纤维细胞增殖的药物是治疗肺纤维化不可缺少的基础。本实验初步研究喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制，为开发有效的抗肺纤维化药物提供基础的实验依据。

1 材料与仪器

喙尾琵琶甲A、B、C提取物，人胚肺二倍体成纤维细胞（上海生物制品研究所），小牛血清（Gibco），RPMI-1640培养基（Gibco），二甲基亚砜（DMSO，Sigma），四甲基偶氮唑盐试剂（Sigma），青霉素、硫酸链霉素（Amersco）；多功能酶标仪（BIO-Tek公司SN255939），倒置显微镜（OLYMPUS公司），CO2培养箱（美国Thermo公司3111），双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司SW-CJ-2F-D）。

2 方法

2.1 喙尾琵琶甲提取物溶液的配制 分别取喙尾琵琶甲干粉各5 g，分别加入90%乙醇、75%乙醇和60%乙醇50 mL，超声提取30 min，过滤、浓缩、干燥。分别制成喙尾琵琶甲A、B、C提取物，提取率分别为1.19%、1.29%、1.96%。3种提取物用DMSO溶解至合适的浓度，作为储备液于冰箱4℃保存。临用前加入培养液制成所需浓度。

2.2 细胞培养及实验分组 人胚肺二倍体成纤维细胞从液氮中取出复苏后，转入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入青霉素100 U∕mL和链霉素 100 U∕mL，置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。实验共设对照组，A、B、C提取物不同质量浓度组（3.9、15.6、62.5、250.0、1 000.0 μg∕mL）。

2.3 MTT（噻唑蓝）法测定喙尾琵琶甲提取物对细胞的增殖抑制作用 取对数生长期人胚肺二倍体成纤维细胞，以0.25%胰酶消化后，加入含小牛血清的培养基终止消化，离心，弃上清，再加入无血清的RPMI-1640培养液，反复吹打细胞，配成细胞悬液，计数并调整细胞密度为2×104个∕μL。以每孔100 μL细胞悬液接种入96孔培养板内，每组设6个复孔，将培养板放入CO2培养箱中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h，使细胞同步。吸弃上清，按组加入含不同浓度3种提取物的培养液（血清含量为1%），并设对照组继续培养24、48、72 h。于每一时间点分别取出培养板，加入5 g∕L的MTT溶液15 μL，37 ℃培养箱中继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL DMSO培养，振荡10 min，于酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度（OD），以下式计算抑制率。抑制率=（1-OD对照∕OD测定）×100%。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0分析软件进行统计学分析，计量资料均以（）表示，采用t检测，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 A提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响 当A提取物的浓度为3.9 μg∕mL时，对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长具有明显的增殖作用；当浓度为15.6 μg∕mL时，随着细胞孵育时间的延长，其对细胞增殖的抑制率逐渐减弱；当A提取物的浓度为62.5～1 000.0 μg∕mL时，其对细胞增殖具有明显的抑制作用，并且随着A提取物浓度和孵育时间的增加而加强。1 000.0 μg∕mL、72 h时，A提取物对细胞的抑制作用最佳，抑制率为49.87%。见表1。

表1 不同浓度A提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

表1 不同浓度A提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

对照组3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-166.75 0.26 16.1 48.57 49.87 0.109 0±0.005 0 0.112 3±0.004 9 0.105 3±0.003 1 0.104 0±0.003 0 0.072 0±0.001 0**0.071 0±0.003 0**———0.275 1 0.154 5 0.062 0＜0.000 1＜0.000 1—-3.06 3.36 4.59 33.94 34.86 0.101 7±0.001 5 0.133 0±0.013 5*0.099 7±0.010 8 0.086 7±0.005 1**0.066 0±0.002 6**0.061 3±0.001 2**0.000 2 0.662 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-30.82 1.97 14.75 35.08 39.67 0.128 3±0.007 8 0.342 3±0.037 5**0.128 0±0.011 5 0.107 7±0.006 8**0.066 0±0.002 6**0.064 3±0.007 6**＜0.000 1 0.958 9 0.000 6＜0.000 1＜0.000 1

3.2 B提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响 当B提取物的浓度为3.9 μg∕mL时，对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长具有一定的增殖作用；当B提取物的浓度为15.6 μg∕mL时，短时间内，B提取物可以促进细胞的增殖，但是随着B提取物与细胞孵育时间延长，其对细胞增殖出现一定的抑制作用；当B提取物的浓度为62.5～1 000.0 μg∕mL时，其对细胞增殖的抑制作用随着B提取物浓度和孵育时间的增加而加强。1 000.0 μg∕mL、72 h时，B提取物对细胞的抑制作用最佳，抑制率为50.13%。见表2。

表2 不同浓度B提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

表2 不同浓度B提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

对照组3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-15.84 5.45 18.96 38.96 50.13 0.109 0±0.005 0 0.114 0±0.003 0 0.113 7±0.001 5 0.108 3±0.001 5 0.077 3±0.002 5**0.070 3±0.001 5**———0.062 0 0.052 0 0.749 3＜0.000 1＜0.000 1—-4.59-4.28 0.61 29.05 35.47 0.101 7±0.001 5 0.116 3±0.003 2**0.099 7±0.001 2*0.086 3±0.001 2**0.072 0±0.011 5**0.062 3±0.003 2**＜0.000 1 0.028 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-14.43 3.93 15.08 29.18 38.69 0.128 3±0.007 8 0.148 7±0.001 5**0.121 3±0.003 8 0.104 0±0.010 0**0.078 3±0.005 7**0.064 0±0.002 0**＜0.000 1 0.076 4 0.000 9＜0.000 1＜0.000 1

3.3 C提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响 当C提取物的浓度为3.9～15.6 μg∕mL时，对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长具有一定的增殖作用；当C提取物的浓度为62.5～1 000.0 μg∕mL时，其对细胞增殖具有显著的抑制作用，并且随着C提取物浓度和孵育时间的增加而加强。1 000.0 μg∕mL、72 h时，C提取物对细胞的抑制作用最佳，抑制率为42.34%。见表3。

表3 不同浓度C提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

表3 不同浓度C提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的影响（,n=6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

对照组3.9 15.6 62.5 250.0 1 000.0—-6.23-5.45 19.22 34.03 42.34 0.109 0±0.005 0 0.112 7±0.002 1 0.112 0±0.006 2 0.102 3±0.004 9*0.086 0±0.004 4**0.071 3±0.001 2**———0.125 6 0.379 9 0.041 0＜0.000 1＜0.000 1—-3.36-2.75 6.12 21.10 34.56 0.101 7±0.001 5 0.107 7±0.009 0 0.106 3±0.006 7 0.087 0±0.005 3**0.068 7±0.007 2**0.066 0±0.002 0**0.138 3 0.131 8＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1—-5.90-4.59 14.43 32.46 35.08 0.128 3±0.007 8 0.136 3±0.002 5*0.135 3±0.001 5 0.103 7±0.004 6**0.084 7±0.002 9**0.074 0±0.003 6**0.037 8 0.056 2＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1

4 讨论

肺纤维化的发病机制复杂多样，肺泡炎症细胞的活化、浸润以及肺成纤维细胞的异常活化、增殖、转型以及分泌细胞外基质共同导致肺纤维化的发生〔11〕。目前的研究认为：成纤维细胞异常增殖是肺纤维化进程中重要的病理特点，处于静息状态下的成纤维细胞受到刺激后过度增殖，引起细胞外基质大量分泌、沉积而取代正常的肺组织，使肺结构遭到破坏〔12-14〕，进而导致肺纤维化。肺纤维化严重威胁人类的生存质量，同时引起人们的广泛关注，但目前临床上尚无治疗肺纤维化的有效药物。因此，以抑制肺成纤维细胞异常增殖为靶点而开展研究是开发防治肺纤维化药物的有效方法。

低浓度的喙尾琵琶甲乙醇提取物促进肺成纤维细胞增殖，同时，高浓度的喙尾琵琶甲乙醇提取物对肺成纤维细胞的增殖具有抑制作用，这与施贵荣等〔6〕发现低浓度喙尾琵琶甲提取物在体外促进人肿瘤细胞株（K562、HL-60、A549）生长，而高浓度喙尾琵琶甲提取物抑制人肿瘤细胞株（K562、HL-60、A549）的生长相一致，但具体作用机制并不明确，需要进一步研究。喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量-效应的依赖关系，并且具有长效的特点。当喙尾琵琶甲乙醇提取物的浓度为1 000.0 μg∕mL、72 h时，对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制效果最好，A、B、C提取物的抑制率分别为49.87%、50.13%、42.34%，3种提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞的抑制效果没有较大差别，但是B提取物的抑制效果稍稍优于A、C提取物。本研究只是涉及喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制作用的初步研究，我们将选用B提取物进一步研究其对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖抑制的机制，为开发安全、长效的抗肺纤维化药物提供基础的实验依据。