李 燕，邵明园，国 超，杨强丽，曹昌娥，赖 泳，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000）

肝纤维化是肝细胞持续性损伤导致机体炎症、组织自我修复慢性激活的过程，若治疗得当或及早、及时治疗可使肝纤维化发生逆转〔1-2〕；反之，则可发展为肝衰竭、肝硬化、肝癌〔3〕。随着肝纤维化的发生、发展，胸腺、脾脏指数可有一定程度的降低；受损的肝脏充血、水肿、代偿性增生、肥大等，肝脏指数随之升高〔4-5〕。肝内巨噬细胞在肝纤维化时产生大量的转化生长因子β1（TGF-β1），促使肝星状细胞（HSC）产生过量细胞外基质（ECM），引起ECM的主要成分Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）水平的上调〔5〕。参与肝细胞损伤、凋亡的自由基（ROS）可使γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）含量增加〔6〕，亦可激活HSC或促进HSC分泌TGF-β1，而生物膜中的不饱和脂肪酸脂质过氧化的产物丙二醛（MDA）可间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度〔7-8〕。

中药治疗肝纤维化对于减缓病情进展具有积极的作用〔4〕，肝龙胶囊是由有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫美洲大蠊（俗称“蟑螂”）研发而成的国家二类中药新药，具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝损伤、修复多种刺激所致的肝损伤及免疫调节的作用〔9-10〕。课题组前期研究结果表明肝龙胶囊能显著降低猪血清诱导的肝纤维化大鼠肝脏中COL-ⅠmRNA、TIMP-ⅠmRNA的表达水平，且临床上肝纤维化非创性早期诊断主要通过检测与ECM生成相关的物质（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ）的代谢水平、细胞因子TGF-β1、γ-GT指标来反映肝纤维化及其程度，所以本文通过猪血清大鼠模型观察肝龙胶囊在抗肝纤维化治疗中对脏器指数、LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA指标的影响，为其临床应用提供实验依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试剂 水飞蓟宾胶囊（天津天士力圣特制药有限公司，批号：16041601）；肝龙胶囊（昆明赛诺制药有限公司，批号：550706087）；猪血清（北京燕生政博生物科技有限责任公司，批号：20210922）；冰醋酸（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20130114）；异氟烷（力诺集团山东科源制药股份有限公司，批号：131102）；COL-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA测试盒，TGF-β1试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20161220）；γ-GT、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20161223、201612237）。

1.2 材料 SD雄性健康成年大鼠，体质量160～200g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证：SCXK（湘）2011-0003；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：ML204∕02）；酶标仪（奥地利安图斯公司，型号：201）；台式离心机（上海离心机械研究所，型号：TL-16R）。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模 SD大鼠适应性饲养3 d后，随机分为空白组、模型组、水飞蓟宾胶囊组（7 mg∕kg）、肝龙胶囊高剂量组（120 mg∕kg）、肝龙胶囊中剂量组（60 mg∕kg）、肝龙胶囊低剂量组（30 mg∕kg），共6组，每组8只。空白组正常饲养，其余各组用未灭活猪血清腹腔注射，每次0.5 mL∕只，2次∕周，连续10周。为维持病因刺激和避免模型自然恢复，治疗期间仍每天腹腔注射1次猪血清，每只注射0.6 mL。

1.3.2 给药 10周造模结束后，空白对照组：给予蒸馏水灌胃，0.5 mL∕100 g；水飞蓟宾胶囊组：7 mg∕kg，3次∕d；肝龙胶囊高剂量组：120 mg∕kg，2次∕d；肝龙胶囊中剂量组：60 mg∕kg，2次∕d；肝龙胶囊低剂量组：30 mg∕kg，2次∕d。给药容量均为0.5 mL∕100 g。

1.3.3 样本采集与处理 末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h。称重、记录，用异氟烷使大鼠吸入麻醉，立即剖开腹腔，腹主动脉取血。血液静置4 h后，以3 000 r∕min的速度离心5 min后，取上层血清，根据各个待测指标所需的量分装后，放于-80℃冰箱保存备用。暴露并取出肝脏、脾脏、胸腺于冰生理盐水中洗涤，滤纸吸干水分，称重、记录并分装于自封袋中，于-80℃冰箱保存备用。

1.3.4 生化指标的检测 将血清、肝脏组织上清液从-80℃冰箱取出，-20℃冰箱过夜后，4℃冰箱解冻，检测前常温放置待用。所有检测指标（LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA）按各自试剂盒说明书操作。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计软件处理，计数资料采用χ2检验，计量资料数据用（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析、LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 大鼠造模前：所有大鼠活泼好动，精神状态良好，毛发光泽，饮食正常。造模期间：各组大鼠的平均体质量均呈逐渐上升趋势，从第5周开始空白组较造模组大鼠体质量增长快，造模前后两组大鼠体质量增加比较差异有统计学意义（P＜0.05）；从第6周开始，造模组大鼠精神萎靡、嗜睡、毛发不整且无光泽，小便颜色较空白组的黄，大便较空白组大鼠更软；给药后：大鼠精神状态改善，脱毛现象减轻，大小便颜色逐渐恢复正常，体质量增长与空白组差异变小。

2.2 肝龙胶囊对猪血清诱导的肝纤维化大鼠体质量、脏器指数的影响 与空白组相比，模型组大鼠肝重指数、脾重指数均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白组相比，模型组大鼠体质量、胸腺指数有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，肝龙胶囊给药组脾重指数、胸腺指数升高，中、高剂量组升高明显（P＜0.05）；肝龙胶囊给药组体质量、肝重指数与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量增加、肝指数、脾指数、胸腺指数比较表（）

表1 各组大鼠体质量增加、肝指数、脾指数、胸腺指数比较表（）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05 ，▲▲P＜0.01 。

空白组模型组水飞蓟宾胶囊组肝龙胶囊0.55±0.19 0.48±0.17 0.74±0.27 0.64±0.11**1.08±0.51**▲▲1.00±0.25▲▲■■■■■低剂量组中剂量组高剂量组225.43±19.01 193.44±21.58 174.36±27.23*219.36±42.37 159.57±6.36*175.58±58.84*2.46±0.14 3.05±0.25**2.96±0.12**2.97±0.28**3.31±0.23**3.04±0.24**1.60±0.16 3.28±0.23**3.33±0.53**3.56±0.26**7.63±1.58**▲▲4.80±2.20**▲

2.3 肝龙胶囊对猪血清诱导的肝纤维化大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影响与空白组相比，模型组大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量均升高（P＜0.05）；模型组大鼠血清COL-Ⅰ、TGF-β1含量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，肝龙胶囊低剂量组使大鼠血清中LN、TGF-β1、PCⅢ、Ⅳ-C含量降低（P＜0.05）；肝龙胶囊中、高剂量组大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；肝龙胶囊给药组大鼠肝组织COL-Ⅰ含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表2 各组大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 肝龙胶囊对猪血清诱导的肝纤维化大鼠肝组织LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影响与空白组比较，模型组大鼠肝组织HA、Ⅳ-C含量升高（P＜0.05）；与空白组比较，模型组大鼠肝组织LN、PCⅢ、COL-Ⅰ、TGF-β1含量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，肝龙胶囊给药组使大鼠肝组织LN含量降低（P＜0.01）；与模型组比较，肝龙胶囊中剂量组使大鼠肝组织HA含量降低（P＜0.05）；肝龙胶囊低、高剂量组使大鼠肝组织HA含量升高，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，肝龙胶囊低、高剂量组使大鼠肝组织Ⅳ-C含量降低（P＜0.01）；肝龙胶囊中剂量组使大鼠肝组织Ⅳ-C含量升高，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，肝龙胶囊中、高剂量组使大鼠肝组织COL-Ⅰ含量升高（P＜0.05）；肝龙胶囊低剂量组使大鼠肝组织COL-Ⅰ含量降低，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，肝龙胶囊低剂量组使大鼠肝组织TGF-β1含量降低（P＜0.05）；肝龙胶囊中剂量组使大鼠肝组织TGF-β1含量升高，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；肝龙胶囊给药组大鼠肝组织PCⅢ含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.5 肝龙胶囊对猪血清诱导的肝纤维化大鼠肝组织γ-GT、MDA含量的影响 模型组大鼠肝组织γ-GT、MDA含量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，肝龙胶囊给药组使大鼠肝组织γ-GT含量降低，其中低、高剂量组与模型组的差异有统计学意义（P＜0.05）；肝龙胶囊给药组大鼠肝组织MDA含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表3 各组肝脏组织LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表3 各组肝脏组织LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 ；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 。

空白组模型组水飞蓟宾胶囊组肝龙胶囊646±136.57 800.33±193.85 631.25±62.38 467.85±213.81▲▲629.88±250.00 590.76±129.71■■■■■低剂量组中剂量组高剂量组16.19±1.19 30.97±8.70**20.74±2.41*▲▲31.15±2.52**24.84±1.07**▲33.91±4.52**540±38.38 597±52.08 528.63±80.38▲484.77±52.63▲▲312.57±55.63**▲▲305.75±47.79**▲▲73.54±4.97 63.15±11.15 49.32±13.07*▲65.91.±8.79 71.19±13.27 64.62±12.45 110.83±6.50 209.01±138.35*65.34±2.45▲▲106.69±1.72▲▲243.72±56.07*82.75±5.41▲▲11.99±8.69 23.10±2.28 17.51±10.37 20.00±3.76 42.79±15.52**▲41.77±4.31**▲

表4 各组肝脏组织γ-GT、MDA含量（，n=8）

表4 各组肝脏组织γ-GT、MDA含量（，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

3 讨论

有文献报道，猪血清以异种抗原的身份侵入，刺激机体产生免疫反应，使机体呈现主动的肝纤维化，或作为炎症因子，刺激机体释放细胞因子，激活HSC，使ECM过度沉积引起肝纤维化〔8〕。其诱导的肝纤维化模型在存在较小的肝细胞损伤、模型持续时间长、自愈率低、对实验结果影响小、对动物整体损伤轻微等特点的同时，具有强烈的免疫应答能力，其纤维化发生机制与临床上慢性肝炎所致肝纤维化接近〔11-12〕。因此，采用猪血清诱导大鼠肝纤维化模型。肝纤维化时，ECM增生、沉积的主要成分是COL-Ⅰ、PCⅢ；由间充质细胞产生的糖胺聚糖HA反映肝纤维化和肝损伤；基底膜的主要成分LN、Ⅳ-C在基底膜增生、肝窦毛细血管化过程中含量增加〔13〕。5种标记物是不同类型的蛋白质，其增加的机制也不同，因此，几个标记物的联合测试具有扎实的理论基础。与空白组比较，模型组大鼠血清及肝脏组织各指标除MDA外，其余指标的含量均高于空白组，是因为猪血清通过MHCⅡ类分子和炎症分子激活HSC转变为肌成纤维细胞（MFB），表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），使肝脏内免疫细胞释放免疫调节因子、细胞因子，导致ECM过度沉积，LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ水平上调，导致肝功能降低，肝功能指标∕肝纤维化间接标志物γ-GT含量增加、肝脏生理结构被破坏，从而形成肝纤维化〔14-15〕；MDA含量未发生变化与猪血清对肝细胞的损伤小，使自由基不能作用于脂质诱导机体发生氧化应激过量产生ROS（活性氧类）有关。

脾脏、胸腺是机体的免疫器官，其脏器指数的高低与免疫功能的强弱、免疫活性细胞的数量有关。肝龙胶囊给药组脾重指数、胸腺指数高于模型组，且胸腺增重一般被认为可能有增强机体免疫力的作用，故提示肝龙胶囊可提高机体的免疫力。肝重指数与模型组比较有轻微的增高或降低，但差异无统计学意义，且给药组大鼠体质量均低于模型组的同时并未做病理检测，可能是体质量的降低造成脏器指数的假阳性增高或降低，所以并不能说明肝脏是否有增生、充血、肥大等现象。

TGF-β1促进肝纤维化有3种途径：首先，TGF-β1抑制基质金属蛋白酶（MMP）或促进基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）表达，抑制ECM降解；其次，TGF-β1通过管状细胞诱导MFB形成上皮间质转化（EMT）；最后，TGF-β1通过Smad3依赖或Smad非依赖途径诱导机制产生〔16〕。受损肝细胞刺激引起巨噬细胞所分泌的TGF-β1与胞膜上的TGF-β1Ⅱ（TβRⅡ）结合，磷酸化的TβRⅡ激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ与Smad2∕3结合，使COL-Ⅰ产生，从而形成肝纤维化〔11，17〕。而Smad蛋白是TGF-β1的关键细胞内效应物，在抗肝纤维化方面，Smad2直接下调COL-Ⅰ表达，或由TGF-β1诱导产生的保护型Smad7通过抑制TβRⅠ与Smad2∕3的结合阻断TGF-β1的过度激活，从而下调COL-Ⅰ表达；在促肝纤维化方面，Smad3直接上调COL-Ⅰ的表达，或Smad4通过调节Smad3上调COL-Ⅰ的表达，亦使ECM过度沉积。药物治疗组大鼠血清和肝脏组织中TGF-β1的含量及大鼠肝脏组织LN含量在一定程度上均低于模型组，提示各药物治疗都起到一定的作用。曾有文献报道〔18〕，肝龙胶囊抗肝纤维化可能与降低肝纤维化细胞因子的表达有关，所以可以解释大鼠肝脏组织LN含量的降低。肝龙胶囊给药组对大鼠肝组织PCⅢ无影响的同时会使COL-Ⅰ的含量增加，表明肝龙胶囊抗肝纤维化的作用机制与PCⅢ、COL-Ⅰ无关。

治疗组中其余各指标对模型组升高的指标不呈线性关系，有的还显示某一浓度降低而其余浓度对其无影响的结果，推测可能的原因是肝龙胶囊对肝纤维化大鼠中升高的各个指标都有不同的适宜的治疗浓度范围，当浓度超过或低于一定范围时，肝龙胶囊对其就没有作用或起相反的作用。对于以上结果，可以考虑与其他药物联合使用，以此为临床治疗提供更好的治疗方案。