陈斌 许轶洲 周亮 杨建敏 叶显华 童国新 黄进宇

心力衰竭主要分为射血分数减少型心力衰竭及射血分数保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）。HFpEF 是左心室舒张功能受损但收缩功能正常的心力衰竭，目前无有效的治疗措施，预后较差。甲羟戊酸途径参与各种生命活动，也参与了多种心血管疾病的发生、发展。我们前期研究发现，HFpEF大鼠心肌组织甲羟戊酸途径相关蛋白及下游活化的Ras蛋白表达升高，另外抑制甲羟戊酸途径中的法尼基焦磷酸合成酶可改善HFpEF大鼠心肌重塑[1]。Ras蛋白为膜结合型三磷酸鸟苷酶，在心血管重塑方面发挥着重要作用，Ramos-Kuri等[2]通过基因工程敲除小鼠ras基因后，可减轻压力负荷诱导的心肌肥厚。Ras蛋白的活化需要法尼基焦磷酸合成酶下游法尼基转移酶（far-

nesyltransferase，FTase）的法尼基化[3]，为进一步研究甲羟戊酸途径在压力超负荷诱导的HFpEF的作用机制，本研究通过抑制FTase来观察HFpEF心肌重构情况，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物和药品 选择190～210g雄性清洁级SD大鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，自由摄食饮水。FTI276（货号：F9553）购自美国Sigma公司，G-LISA试剂盒购自美国Cytoskeleton公司，苏木精染液、伊红染液均购自谷歌生物，中性树胶、二甲苯、无水乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验分组 采用随机数字表法将雄性SD大鼠分为手术组、FTase抑制组（FTI组）及假手术组，每组10只，3组大鼠术前禁食24h，禁水12h。手术组：2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定于动物手术台上，腹中线区剃毛、消毒、剪开腹壁，切口长度约3cm，暴露出腹主动脉，在发出右肾动脉上方5mm处，用手术线（4-0）把腹主动脉和两端磨钝的22G注射器针头一起扎紧，拔出针头，造成腹主动脉在结扎点处内径缩窄（腹主动脉在结扎点恢复再通后的内径为22G针头外径），小肠复位，关腹。FTI组：麻醉、暴露腹主动脉、腹主动缩窄等步骤同手术组，关腹后腹部皮下注射FTI276，每隔1d以300μg/kg持续注射8周。假手术组：麻醉及暴露腹主动脉同手术组，但不结扎腹主动脉，小肠复位，关腹。

1.3 观察指标 （1）心脏超声指标：大鼠麻醉后，剃除胸部被毛、消毒，取左侧卧位。M型超声图像长轴切面分别测量左心室收缩末期内径（LVIDs）和舒张末期内径（LVIDd）；舒张末期室间隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd）；系统计算出左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（shortening fraction，FS）。采用脉冲多普勒经心尖部四腔切面测量左心室早期充盈流入峰值速度（E峰）和晚期充盈流入峰值速度（A峰），由此计算出E/A比值。同时计算二尖瓣E峰减速时间（deceleration time，DT）。各指标均在连续3个心动周期上测量取平均值。（2）血压、左心室肥厚指数及Ras蛋白活性：采集完大鼠心脏超声指标第2天，麻醉大鼠并分离出右颈总动脉，将与压力换能器及Medlab生物信号采集处理系统连接的聚乙烯管插入右颈总动脉，采集收缩压、舒张压及左心室舒张末期压力（LVEDP）。处死大鼠后取出心脏并分离出左心室称重，计算左心室质量与体重的比值（left ventricular weight/body weight，LVW/BW），剪取一部分左心室组织置于10%中性甲醛溶液固定24h，石蜡包埋，用于HE和Masson染色。酶标仪在吸光度490nm处检测左心室组织Ras蛋白活性。

1.4 统计学处理 采用SPSS24.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠血压及左心室指标比较 见表1。

表1 3组大鼠血压及左心室指标比较

由表1可见，与假手术组比较，手术组收缩压与舒张压明显升高，左心室质量及LVW/BW增加，差异均有统计学意义（t=12.01、16.11；10.91、6.18，均P＜0.01）。FTI组较手术组血压无降低，但左心室质量及LVW/BW均减少，差异均有统计学意义（t=-2.23、-6.21，均P＜0.05）。

2.2 3组大鼠心脏超声比较 3组大鼠心脏超声指标比较见表2。3组大鼠左心室M型超声比较见图1。

由表2可见，与假手术组比较，手术组IVSd与LVPWd均明显升高，差异均有统计学意义（t=9.33、6.76，均P＜0.01）；与假手术组比较，手术组E/A比值明显降低，DT明显延长，差异均有统计学意义（t=-2.72、4.34，均P＜0.05）。与手术组比较，FTI组IVSd与LVPWd均明显降低，差异均有统计学意义（t=-3.48、-3.56，均P＜0.05）。由图 1 可见，手术组IVSd、LVPWd 均较假手术组增厚，FTI组 IVSd、LVPWd较手术组降低。

表2 3组大鼠心脏超声指标比较

图1 3组左心室M型超声比较（A：FTI组；B：手术组；C：假手术组。图中虚线为测量线）

2.3 3组左心室心肌及左心室心肌内血管的病理图见图2（见封三）。

图2 3组左心室心肌及左心室心肌内血管的病理图（A：FTI组，H E染色，×400；B：手术组，H E染色，×400；C：假手术组，H E染色，×400；D：FTI组，M asson 染色，×400；E：手术组，M asson 染色，×400；F：假手术组，M asson 染色，×400）

通过计算3组左心室心肌细胞横截面积发现：与假手术组比较，手术组心肌细胞横截面积明显变大[（304±21）μm2vs（409±34）μm2]，差异有统计学意义（t=10.26，P＜0.01），FTI组心肌细胞横截面积（354±35）μm2较手术组（409±34）μm2变小，差异有统计学意义（t=-3.76，P＜0.05）。另外，Masson染色发现腹主动脉缩窄可引起心肌内血管周围纤维化，而FTI276可改善血管周围纤维化。

2.4 3组左心室心肌组织Ras蛋白活性比较 手术组左心室组织Ras蛋白活性[（0.632±0.064）nm]高于假手术组[（0.412±0.043）nm]，差异有统计学意义（t=2.76，P＜0.01），而FTI组Ras蛋白活性[（0.544±0.044）nm]较手术组[（0.632±0.064）nm]降低，差异有统计学意义（t=-2.23，P＜0.05）。

3 讨论

高血压是引起HFpEF的一个主要危险因素，高血压患者中一半有左心室舒张功能障碍，基于高血压的高发病率，探索高血压导致的HFpEF迫在眉睫。

Ras蛋白是参与重要信号传导通路的小G蛋白，这些蛋白存在于所有的真核生物，在一系列的生理过程中发挥着重要作用，如细胞增殖、分化及干细胞多能性[4]。研究发现Ras蛋白与许多心血管疾病相关[5]，抑制Ras蛋白后可减轻心肌肥厚，甚至可延缓代偿性心肌肥厚到舒张功能障碍的转变[6-7]。Ras蛋白转录后需要一系列的修饰才能与细胞膜结合，在这里Ras蛋白与细胞膜上的受体结合，从而激活下游的信号通路[8]。Ras蛋白转录后修饰的第一步也是最关键一步，是其羧基末端与法尼基的共价结合，即法尼基化，FTase是胞质内Ras蛋白法尼基化的限速酶，且这个过程是不可逆的，法尼基化后的Ras蛋白才能与细胞膜结合，发挥活性作用[9-10]。因此抑制FTase可阻止Ras蛋白与细胞膜结合，从而抑制其激活的一序列信号通路。从细胞到动物模型，FTase抑制剂在治疗肿瘤已取得一定成效，部分FTase抑制剂已经进行了临床试验[11-12]。

当血压升高时，左心室后负荷增加，为了维持恒定的室壁张力，心肌发生肥厚及纤维化，这是一个正常的生理调节过程。但如果压力超负荷持续存在，则进展成病理性心室重构，过度的心肌肥厚及纤维化将影响左心室舒张功能，最后导致舒张功能障碍[13]。部分研究发现HFpEF的严重程度和心肌纤维化成正比[14]。本研究发现，FTase抑制剂可直接引起心肌Ras蛋白活性下降，同时可改善心肌肥厚及纤维化，但并没有引起血压明显下降。因此，我们推测，FTase抑制剂是直接改善心肌肥厚和纤维化，而不是通过降低血压来影响心肌重塑。本研究并未发现FTase抑制后左心室舒张功能得到改善，这可能有多方面的原因，笔者认为药物干预的时间不够长可能是其中原因之一。

结合笔者以往及本次研究，我们可以推测Ras蛋白在大鼠压力超负荷诱导的HFpEF中发挥着重要作用，而FTase抑制剂也许是治疗HFpEF一个潜在的药物。