小叶锦鸡儿的组织培养

2018-12-12孔冬梅王兴勇史智敏

山西大学学报（自然科学版） 2018年4期

孔冬梅,王兴勇,史智敏

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.中国水利水电科学研究院,北京 100038)

0 引言

小叶锦鸡儿(Caraganamicrophylla)是豆科锦鸡儿属的落叶灌木,具有抗旱、抗寒、耐盐碱和耐瘠薄的生理特性,在防风固沙、保持水土和美化环境等方面具有较强的优势[1-3],同时富含氮、磷、钾等元素,既可做良好的灌木绿肥[4-5],又可为畜牧业提供优质饲料[6-7],因此具有重要的生态价值和经济价值。小叶锦鸡儿在我国的人工栽培历史较短,生产上一般以播种育苗为主,易受气温、湿度、地势、虫害等影响而出苗慢,苗木质量参差不齐[8-9]。组织培养是提高优良基因型的选择效率、加速优良基因型纯合过程的有效手段和途径。

目前,国内对于锦鸡儿属组培快繁的研究以柠条锦鸡儿(C.korshinskii)报道较多[10-14],其次是小叶锦鸡儿[15-17]。就现有报道来看,锦鸡儿属各个种使用外植体材料不同,诱导、继代、增殖、生根等培养基的浓度配比等也各有所异,究竟哪种外植体和哪种培养体系更适合于小叶锦鸡儿的组培扩繁还有待于进一步的研究。本研究以小叶锦鸡儿的离体茎段和种子为起始材料进行愈伤组织、芽丛和不定根的诱导,以期获得小叶锦鸡儿组培快繁的可行途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

材料采集地点位于山西五寨县胡会乡石咀头村,111.8175°E,38.9771°N,海拔1 400 m,属于干旱半干旱的丘陵风沙区,昼夜温差大,年平均气温4.9 ℃左右,≥10℃的年积温2 452℃,无霜期120 d左右,平均降雨量478.5 mm,全年降水量主要集中在7～8月。

2016年5月从小叶锦鸡儿植株采集幼嫩枝条,用冰盒带回实验室,尽快灭菌备用;同年秋季采集当年成熟的种子,室内冰箱保存。

1.2 以幼嫩枝条作为起始材料的培养

1.2.1 外植体制备

将幼嫩枝条在室内自来水冲洗30 min后,无菌条件下按如下程序进行表面消毒:体积分数70%酒精浸泡10 s-无菌水冲洗数次-质量分数0.1%升汞浸泡10 min-无菌水清洗数次。将灭菌后的嫩枝分别当年生未木质化嫩茎和2年生木质化枝条,切成带1个腋芽的茎段作外植体。

1.2.2 腋芽诱导

以MS为基本培养基,调整其铁盐为基本含量的2/3,其中添加0.2或0.5 mg/L 细胞分裂素(6-BA)和0.01 mg/L 吲哚乙酸(IAA)。

1.2.3 继代培养

将诱导伸长的腋芽切成带1个节的茎段在添加0.5 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的培养基上进行继代,之后每4周左右按相同方法进行1次继代。

1.3 以成熟种子作为起始材料的培养

1.3.1 材料的灭菌

选取饱满健康种子,用蒸馏水冲洗数遍,70%酒精浸泡10 s,无菌水冲洗数次,转入0.1%升汞浸泡10 min,再用无菌水清洗数次,然后将种子在无菌水中浸泡8 h备用。

1.3.2 无菌苗的获取

在无菌条件下将部分种子去除种壳,另一部分不去除种壳,接种在不含激素的MS培养基上,放入培养室培养。

1.3.3 外植体的获取和培养

从萌发2周的健康幼苗上切取子叶(0.5 cm×0.5 cm)、真叶(0.5 cm×0.5 cm)、茎段(带一个节)和下胚轴(0.5 cm),分别培养在附加1.0、1.5或2.0 mg/L萘乙酸(NAA)和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上。

1.3.4 继代培养

对诱导出来的愈伤组织,切割成0.5 cm见方的小块,在添加1.0或2.0 mg/L NAA和6-BA组合,或只添加0.5 或1.0 mg/L 6-BA的MS培养基上进行继代,以后每4周转移到相同培养基继续培养。对诱导出的芽丛,每4周将其切割成带一个节的茎段在相同培养基上继代。

1.4 生根培养

将MS培养基中大量元素调整为基本含量的1/2、1/4和1/8,并分别添加0.5 mg/L吲哚丁酸(IBA)、NAA、IAA,或同时添加0.5 mg/L IBA和NAA,将伸长至2.0 cm以上的芽接种于这些培养基上进行生根诱导。

1.5 培养基和培养条件及数据分析

培养基均添加蔗糖1.5%、琼脂0.6%,pH值5.8,在121℃、1.1 kg/cm2压力下灭菌20 min。培养室温度(25±2)℃, 光照16 h/d、光照强度1 000～2 000 lx。

所有培养均重复3次,结果用平均值以平均数±标准差(SE)表示,用Prism6软件来进行方差分析和差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 以幼嫩枝条作为起始材料的培养

2.1.1 腋芽诱导

观察发现,2年生木质化茎段在两种诱导培养基上无生长迹象,并在数天内陆续死亡。未木质化的当年生茎段在两种培养基上均有少量腋芽萌发,培养40 d时,添加0.5 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的MS培养基上有31.54%的腋芽诱导率,显著高于添加0.2 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的培养基(p<0.05)(表1)。

表1 茎段腋芽诱导效果

2.1.2 芽增殖

继代培养观察发现,在第二次继代以后陆续有一些茎段发生了增殖,一般1个外植体上芽增殖到2～3个,但增殖率很低,只有约20%。第三次继代后,生长势逐渐减弱,并且出现白化现象。

2.2 以种子作为起始材料的培养

2.2.1 无菌发芽

无菌条件下种子1周后陆续发芽。观察发现,完整种子均可正常萌发,且出芽快而整齐,但去壳种子萌发率低,究其原因是因为去壳导致部分种子的胚受到损坏。

2.2.2 愈伤组织诱导

培养4周时,对来自幼苗的不同外植体在3种不同激素组合的MS培养基上愈伤组织诱导率进行统计。由表2可看出,4种外植体的愈伤组织诱导率均较高,其中下胚轴和带节茎段在3种培养基上的愈伤组织诱导率均为100%。而不同激素组合对子叶和真叶的愈伤组织诱导率影响显著(P<0.05),二者在1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上,愈伤组织诱导率分别为85.56%和78.66%,随着NAA浓度逐渐增高,诱导率明显提高,当NAA浓度达到2.0 mg/L时,子叶和真叶的愈伤组织诱导率也分别达到或接近100%。由此表明,小叶锦鸡儿实生苗外植体均适合愈伤组织的诱导。

2.2.3 愈伤组织继代培养

观察发现,愈伤组织每次继代后均有明显的增殖现象,但只在第一次继代后有0.67%-15.33%的不定芽诱导率,之后的继代不仅无不定芽发生,愈伤组织的的活力也逐渐减弱,甚至褐化死亡。这表明实生苗的愈伤组织容易获得,但愈伤组织的进一步培养还需要寻找更合适的培养条件。

表2 4种外植体愈伤组织诱导率

表3 愈伤组织分化

2.2.4 腋芽诱导与继代

所有带节茎段在3种激素组合的培养基上,在基部形成愈伤组织的同时,上部也在不断生长,同时有大量芽丛发生,这些芽丛是节部腋芽萌发并增殖所致。在添加2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上继代培养后,芽丛增值率高达98.92%,显著高于另外两组处理(P<0.05)(表4)。在该培养基上3次继代后腋芽诱导和增殖效果都能达到或接近100%。

表4 无菌苗茎段初代培养效果

2.2.5 生根培养

在所设计的12种生根培养基上培养4周后发现,只在1/8MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA的培养基上,有少量不定根发生,生根率为12.41%(表5),根系白色健康。

3 讨论

目前锦鸡儿属的组培扩繁使用的外植体基本是茎段,包括直接从野外植株上采集的茎段和来自无菌实生苗的茎段,就植株再生途径来说,基本实现了从无菌苗诱导芽丛的直接发生和植株再生,还未见通过愈伤组织诱导不定芽实现植株再生的报道。本研究也只通过无菌苗茎段的腋芽诱导实现了植株再生。

有研究者在中间锦鸡儿(C.intermedia)和柠条锦鸡儿的培养中成功诱导了愈伤组织的发生,但都未实现愈伤组织的分化[10,12,18]。本研究虽然从小叶锦鸡儿获得了100%的愈伤组织诱导率,但愈伤组织分化率最高也仅有15.33%,并且在后续的继代培养中发现愈伤组织快速老化。因此愈伤组织的继代培养和分化是锦鸡儿属离体培养应该解决的一个问题。

表5 生根诱导

从已有报道来看,小叶锦鸡儿无菌苗茎段的芽丛诱导率最高已达94.8%[16],本研究在MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培养基上基本实现了100%芽丛诱导和增殖。但不定根的诱导研究结果却相差较大。张强等(2005)研究发现适合不定根诱导的培养基组合是MS+0.4 mg/L IAA+0.2 mg/L IBA[16],牛西午等(2005)发现不定根发生所适合的最佳培养基为1/2MS+0.5 mg/L IAA,并且认为IAA对小叶锦鸡儿生根的作用好于NAA和IBA[15]。而本研究在添加IAA的培养基上没有根的发生,只在1/8MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培养基上实现了低频率的根发生。所有报道结果在培养基营养和激素配比上均有较大差异。这可能是由于不定根发生是组培的最后一个环节,不仅直接受到生根培养基的影响,还受到之前芽诱导和增殖阶段各种因子滞后效应的影响。因此,进一步扩大培养基和激素组合的试验范围,诱导高频率不定根发生是建立小叶锦鸡儿组培技术体系的关键。