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(淮南师范学院生物工程学院,安徽淮南 232038)

纤孔菌属(Inonotusspp.)是一类具有黄色至浅红色椭圆形、无拟糊精担孢子的一年生单系菌丝系统[1],该属有80多个种[2],比较常见的有粗毛纤孔菌(I.hispidus)、斜生纤孔菌(I.obliquus)、柳生纤孔菌(I.pruiosus)、薄皮纤孔菌(I.cuticularis)和辐射状纤孔菌(I.radiatus)等[3]。粗毛纤孔菌(Inonotushispidus),主要寄生在榆树、桑树、苹果木、栎树、水曲柳、桃树等阔叶树的树干上[4],为桑黄的一种,是一种珍贵的药用真菌,在我国东北地区用于治疗消化不良等胃病[5],在新疆南部主要用于治疗癌症、糖尿病、痛风和关节炎等[6],在德国民间用作泻药,具有净肠通便的作用[4]。

目前关于粗毛纤孔菌的研究主要集中在驯化栽培[7-8]、其生物活性研究主要集中在降血脂[9]、抗肿瘤[10-12]方面,活性成分研究主要集中在三萜[13-15]和多糖[16]的提取、分离和活性研究,关于多酚类物质的分离纯化及活性研究相对较少。而多酚类物质是一类重要生物活性成分,具有多种生理活性。昝立峰[17]在寄生于新疆南部古老桑树上的粗毛纤孔菌子实体中分离鉴定出15个化合物,其中包括9个多酚类物质,牛奶树碱、Hispolon、Inonotusin A、Inonotusin B、原儿茶酸和原儿茶醛等。其中主要化合物Hispolon可以有效地清除DPPH·、ABTS+·、·OH多种自由基[18-19],具有良好的抗氧化活性。

本文以采自塔吉克斯坦沙拉土日当地桑树上的野生桑黄子实体为研究对象,对菌株进行分类鉴定,对其抗氧化活性和抑菌活性及其与总多酚、总黄酮之间的相关性进行较为系统地研究,为其进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生桑黄子实体(SH) 采集于塔吉克斯坦沙拉土日,分离自当地桑树,粉碎,常温保存备用;草莓灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、大肠杆菌(Bacilluscoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 淮南师范学院生物工程学院微生物实验室;真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(SK8230) 生工生物工程(上海)有限公司;Fungi Identification PCR Kit(RR178) TAKARA公司;福林酚(Folin-Cilcalteu)试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、水溶性维生素E(Trolox) Sigma公司;没食子酸、芦丁 上海融禾医药科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏、琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司。

KQ-400B型超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司;LDZW-60KCS-ll型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械;BSC-250型恒温恒湿箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;RE-201D型旋转蒸发仪 郑州予华仪器制造有限公司;SW-CJ-2D型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分子生物学鉴定 取20 mg干燥的子实体用液氮研磨成粉末,加入缓冲液和β-巯基乙醇,振荡混匀,于65 ℃水浴中裂解。按照试剂盒说明提取基因组DNA,最后提取的基因组DNA溶于100 μL TE缓冲液,于-20 ℃保存备用。ITS区序列扩增体系(50 μL):模板DNA 1 μL,PCR预混料25 μL,正向引物0.5 μL,反向引物0.5 μL,重蒸水23 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,50～55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃末端延伸5 min,4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检验后，送通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。所得序列通过BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast)进行序列相关性分析,提交到GenBank获得序列号,利用Clustal_X软件对所得序列进行校正和比对分析,采用MEGA 4.0软件、以Neighbor-joining法构建系统发育树[8]。

1.2.2 子实体提取物制备 参考马迪等[20]的方法略作修改。称取桑黄子实体粉末 0.5 g 4份,分别加入20 mL甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿,在60 Hz,40 ℃条件下超声提取30 min,提取液用定性分析滤纸进行真空抽滤,收集滤液,将残渣按照相同条件再提取2次,合并3次收集到的滤液,于45 ℃下减压蒸发浓缩至干,分别溶于5 mL二甲基亚砜(DMSO)得到4种不同溶剂提取物浓缩液(100 mg/mL),4 ℃保存,备用。

1.2.3 总多酚含量测定 采用福林酚试剂法。参考Cai等[21]的方法,稍作修改。取1.0 mL样液于小试管中,加入5.0 mL蒸馏水,1.0 mL 0.2 mol/L福林酚试剂,3.0 mL 7.5%Na2CO3,摇匀后置于25 ℃下避光反应2 h,765 nm处测定吸光值。空白作对照调零,以没食子酸为标准物质制作标准曲线(0～0.04 mg),结果换算成每克子实体相对于没食子酸的量(mg没食子酸/g),实验重复3次。标准曲线方程为Y=11.236X+0.007,R2=0.9991。

1.2.4 总黄酮含量测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝法。参考刘艳芳等[22]的方法,稍作修改。取3.0 mL样液于试管中,加入0.2 mL 5%(w/v)亚硝酸钠溶液,摇匀后静置反应6 min,再加入0.2 mL 10%(w/v)硝酸铝摇匀后静置反应6 min,再加入0.6 mL 4%(w/v)氢氧化钠,摇均后静置反应15 min,510 nm下测定吸光值,空白作对照调零。以芦丁为标准物质制作标准曲线,结果换算成每克子实体相当于芦丁的量(mg芦丁/g),标准曲线方程为Y=0.0233X+0.0006,R2=0.9993。

1.2.5 DPPH· 清除能力的测定 参考Vieira等[23]的方法,取2.0 mL 0.05 g/L DPPH无水乙醇溶液,加入2.0 mL样品液,摇匀,置于25 ℃水浴中避光反应20 min,以蒸馏水调零,于517 nm处测定吸光度值。以Trolox为标准物质制作标准曲线,各溶剂提取物的自由基清除能力以Trolox当量抗氧化能力(Tolox equivalent antioxidant activity,TEAC)表示,它代表与1 g子实体具有相同抗氧化能力所需Trolox的毫克数(mg Trolox/g),标准曲线方程为Y=-0.0276X+0.8217,R2=0.9962。

1.2.6 铁离子还原能力(FRAP)测定 铁离子还原能力测定方法参考李昕等[24]的方法,将0.1 moL/L醋酸盐缓冲液(pH3.6)、10 mmoL/L TPTZ溶液(溶于40 mmoL/L盐酸)、20 mmoL/L氯化铁溶液按10∶1∶1混匀,得到 FRAP 工作液。取0.1 mL样品溶液加入到2.45 mL FRAP工作液中,充分混合后避光反应60 min,于593 nm处测定其吸光度。以Trolox为标准物质制作标准曲线,各溶剂提取物的FRAP用TEAC表示,标准曲线方程为Y=0.1475X+0.0453,R2=0.9992。

1.2.7 ABTS+·清除能力的测定 参考陈志娜等[25]的方法,取7 mmol/L ABTS溶液5 mL,加入140 mmol/L过硫酸钾溶液88 μL,室温下避光放置12～16 h,使用前用无水乙醇调零,在734 nm处用无水乙醇将其吸光值调整至0.700±0.05,作为ABTS工作液备用。

取样品液0.5 mL,加入3 mL ABTS工作液,摇匀后置于25 ℃水浴避光反应30 min,用无水乙醇调零,在734 nm处测定吸光值。以Trolox为标准物质制作标准曲线,各溶剂提取物的自由基清除能力用TEAC表示,标准曲线方程为Y=-0.0313X+0.6753,R2=0.9983。

1.2.8 抑菌活性测定 采用牛津杯法测定抑菌活性[26]。

1.2.8.1 菌种的活化及菌悬液的制备 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌从斜面上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,于37 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养16 h,再用无菌生理盐水将菌液稀释至107～108cfu/mL,振荡均匀后备用。

草莓灰葡萄孢霉于恒温培养箱中(温度28 ℃,湿度85%)培养5 d,用接种环挑取少许孢子于装有玻璃珠和10 mL无菌生理盐水的三角瓶中,振荡,采用血细胞计数法测定菌数[27],制成孢子浓度为104～105cfu/mL的孢子悬液,振荡均匀后备用。

1.2.8.2 牛津杯法测定抑菌效果 参考王娣等[28]的方法,略作修改。取灭菌烘干的牛津杯(外径8 mm、内径6 mm、高10 mm)置于已用100 μL菌悬液涂布均匀的培养皿中,用无菌微量移液器分别注入150 μL子实体不同溶剂提取物,于恒温培养箱中(温度28 ℃,湿度85%)培养12 h后,采用十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.3 数据处理

结果采用3次平行实验的平均值±标准差表示。使用SPSS 18.0软件对实验结果进行统计分析(One-way ANOVA),利用Duncan’s multiple range test方法进行显著性分析,选取p<0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 分子生物学鉴定

经PCR扩增和序列测定,获得菌株的ITS序列片段,GenBank登录号为MG655159。进一步经过BLAST在线比对,与Inonotushispidus(EU282484.1)的相似性为99%,并利用MEGA 4.0软件与相近种构建系统发育树,如图1所示,确定菌种为粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)。

图1 基于SH菌株ITS序列建立的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences of SH

2.2 总多酚和总黄酮含量

粗毛纤孔菌不同溶剂提取物的总黄酮、总多酚含量测定结果见表1。从表1可以看出,粗毛纤孔菌不同溶剂提取物的总黄酮、总多酚含量存在显著差异,总黄酮和总多酚含量从高到低的提取溶剂依次为甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿,其中甲醇提取物中的总黄酮含量为(14.78±0.16) mg芦丁/g,总多酚含量为(67.42±1.41) mg没食子酸/g。

表1 粗毛纤孔菌不同溶剂提取物的总黄酮、总多酚含量 Table 1 Total flavonoid and polyphenol of Inonotus hispidus by different solvents

2.3 抗氧化活性

不同抗氧化检测方法的反应机理不同,为得到可靠的结论,本实验采用DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和FRAP法，对粗毛纤孔菌子实体不同溶剂提取物的抗氧化活性进行评价,结果换算成Trolox当量抗氧化能力(Tolox equivalent antioxidant activity,TEAC)[29]。由图2可知,粗毛纤孔菌子实体不同溶剂提取物的抗氧化活性存在显著性差异,4种不同溶剂提取物对ABTS+·清除能力从(9.35±0.19)到(116.08±0.24) mg Trolox/g,其中70%乙醇提取物的清除能力最强,氯仿提取物的最弱;4种不同溶剂提取物对铁离子的还原能力从(11.20±0.26)到(126.24±3.02) mg Trolox/g,其中甲醇提取物的最强,氯仿提取物的最弱;4种不同溶剂提取物对DPPH·清除能力从(6.53±0.02)到(43.83±0.03) mg Trolox/g,其中70%乙醇提取物的最强,氯仿提取物的最弱。

图2 粗毛纤孔菌不同溶剂提取物的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of extracts from Inonotus hispidus by different solvents注:小写字母不同表示不同提取溶剂的相同测定指标差异显著(p<0.05)。

2.4 抗氧化活性与总多酚、总黄酮相关性分析

粗毛纤孔菌提取物的抗氧化活性与总多酚、总黄酮之间的相关性见表2。总多酚、总黄酮含量与FRAP法之间存在极显著(p<0.01)正相关,相关系数分别为0.989和0.825,与钱骅等[30]的报道相似,其研究发现桑黄子实体的抗氧化活性(FRAP法)与多酚和黄酮含量呈线性正相关(R2为0.997和0.995)。总多酚含量与DPPH·和ABTS+·清除能力之间存在显著(p<0.01)正相关,相关系数为0.622和0.695,而总黄酮含量与DPPH·和ABTS+·清除能力之间不相关。有研究发现薄荷、嘉宝果叶片等不同溶剂提取物清除DPPH·和ABTS+·的清除能力与黄酮含量相关性较小[31-32],与本研究结果类似。此结果进一步说明多酚类物质是粗毛纤孔菌抗氧化能力的关键物质。目前,从粗毛纤孔菌中分离出的具有抗氧化活性的酚类化合物主要有牛奶树碱、inonotusin A和inonotusinB[33]。

表2 粗毛纤孔菌提取物的抗氧化活性与总多酚、总黄酮之间的相关性Table 2 Correlation coefficients of antioxidant activity between total polyphenol and total flavonoid extracts from Inonotus hispidus

2.5 抑菌活性

粗毛纤孔菌不同溶剂提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及草莓灰葡萄孢霉的抑制效果如表3所示。从表3可以看出,除氯仿提取物外,其余3种提取物对实验所用的3种指示菌都具有良好的抑制效果,其中,甲醇提取物的抑菌活性最佳,70%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物次之。另外,各溶剂提取物对3种指示菌的抑制效果呈现一定的选择性。其中,3种提取物对草莓灰葡萄孢霉的抑制效果均明显强于细菌,且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于大肠杆菌。

表3 粗毛纤孔菌不同溶剂提取物的抑菌活性Table 3 Antimicrobial activity of extracts from Inonotus hispidus by different solvents

结合表1中各提取物中的总黄酮、总多酚含量可知,提取物中的多酚含量明显高于黄酮含量,且甲醇提取物中的多酚含量最高,猜测抑菌活性可能与粗毛纤孔菌子实体提取物中的多酚类化合物有关。此结果与Liu等[34]和Benarous等[35]的研究一致,他们研究发现纤孔菌属中的主要抑菌物活性物质为芦丁、绿原酸和牛奶树碱等酚类化合物。

3 结论

本实验以采集于塔吉克斯坦沙拉土日地区桑树上的桑黄子实体为研究对象,利用rDNA ITS序列分析将其鉴定为粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)。进一步研究了其子实体不同溶剂提取物中的总黄酮、总多酚与抗氧化活性的相关性以及4种溶剂提取物的抑菌活性。结果表明,粗毛纤孔菌不同溶剂提取物中的总黄酮、总多酚、抗氧化活性和抑菌活性存在显著差异,其中甲醇提取物中的总黄酮和总多酚含量最高,分别为(14.78±0.16) mg芦丁/g和(67.42±1.41) mg没食子酸/g。70%乙醇提取物的ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力最强,甲醇提取物的铁离子还原能力最强。

相关性分析显示总多酚和总黄酮与FRAP法之间的相关系数达到0.989和0.825,极显著(p<0.01)正相关。总多酚与ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力之间的相关系数为0.695和0.622,显著相关(p<0.05),而总黄酮与ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力之间不相关,说明多酚类物质对粗毛纤孔菌抗氧化活性起到了关键性作用。抑菌结果显示,70%乙醇提取物和甲醇提取物表现出较好的抑菌效果,其中对草莓灰葡萄孢霉的抑菌效果最好(抑菌圈直径>30 mm),其次是对金黄色葡萄球菌(抑菌圈直径>15 mm),对大肠杆菌的抑菌效果最差(抑菌圈直径>10 mm)。