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(1.华中农业大学食品科技学院,环境食品学教育部重点实验室,湖北武汉 430070; 2.湖北省食品质量安全监督检验研究院,湖北武汉 430075)

甜橙精油是由85%～99%的挥发性物质和1%～15%的非挥发性物质组成的,其中挥发性物质主要由单萜类物质和倍半萜烯类物质及其氧化物构成[1]。据报道,甜橙精油具有良好的抑菌作用[2-3],且其抑菌特性与高含量的挥发性物质有关,尤其是柠檬烯[4]。Viuda-Martos等[5]利用琼脂稀释法研究四种柑橘精油对黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)和产黄青霉(PenicilliumChrysogenum)的抑菌作用,实验结果表明柑橘精油对霉菌有较好的抑制作用。柑橘精油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,尤其是大肠杆菌(Escherichiacoli)的抑菌作用最显著,其次为白色葡萄球菌(Staphylococcuscremoris),对青霉菌(Penicilliumsp)效果较弱[6]。植物精油的抑菌活性与精油的成分及所用的试验菌种有关[7],D-柠檬烯是甜橙精油中含量最高的成分,其含量高达70%以上[8-10]。李巧巧等[11]对商用柑橘精油和其主要成分D-柠檬烯对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和霉菌(Penicilliumsp.)进行抑菌实验,发现D-柠檬烯的抑菌效果最好。柑橘精油不溶于水,易溶于有机溶剂,如果将其直接加入到食品或饮料中,低水溶性使其抑菌效果大大减弱,并出现分层现象,影响外观。

然而,直接使用甜橙精油用于食品中腐败菌的抑制存在很多限制,比如精油的水不溶性、不稳定性及挥发性强等[12]。纳米乳液(nanoemulsion)是一类粒径大小为10～100 nm的胶体分散系统[13],主要由油、水、表面活性剂和助表面活性剂四种成分组成[14],具有大小均匀的透明或半透明、热压灭菌或高速离心稳定的性质[15],是动力学稳定体系。因此,将甜橙精油制备成纳米乳液可以克服直接使用精油存在的不足。此外,Kavas等[16]发现将甜橙精油添加于可食性膜中也能够显著增强其抑菌活性。

本文通过制备甜橙精油和D-柠檬烯纳米乳液,采用抑菌圈法和最低抑菌浓度法研究甜橙精油和D-柠檬烯纳米乳液对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)四种微生物的抑菌作用。并测定了甜橙精油和D-柠檬烯纳米乳液的抑菌圈直径及MIC,判定其抑菌性强弱。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

甜橙精油(Citrussinensis(L.)Osbeck) 取自秭归县屈姑食品有限公司;大肠杆菌ATCC25922(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003(Staphylococcusaureus)、桔青霉ATCC1109(Penicilliumcitrinum) 上海鲁微科技有限公司;牛肉膏、麦芽浸粉、氢氧化钠、无水乙醇、吐温80、琼脂、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨 北京双旋微生物培养基制造厂;D-柠檬烯(97%) 美国Sigma-Aldrich公司。

LAS V4.5显微镜 德国徕卡公司;PB-10型pH计 德国Sartorius公司;DH3600BII型电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;KYC-100B恒温摇床振荡器 上海新苗医疗器械制造有限公司;LX-C35L型数显型自动电热压力蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司;Nano-ZS90型马尔文激光粒径仪 英国马尔文公司;UV-1750紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液的制备 准确称取2.0 g甜橙精油和D-柠檬烯,分别并按剂油比(表面活性剂吐温80与精油的比值=6∶4)在25 ℃下加入吐温80 3.0 g,混合均匀,此溶液即为油相。助表面活性剂为无水乙醇,按表面活性剂(吐温80)-助表面活性剂比例(Km)为7∶1(质量比),称取无水乙醇0.43 g,将无水乙醇与约5 mL去离子水混合均匀,然后加入0.01 g氯化钠,混匀,然后再用去离子水将上述溶液定容至10 mL,此溶液即为水相。用玻棒逆时针均速缓慢搅拌油相,并以1.0 mL/min的速度向小烧杯中加入10 mL水相。最后放入搅拌转子,置于磁力搅拌器上,转速1500 r/min,搅拌6 h。注意搅拌速度不能太快,否则无法形成纳米乳液。根据作者前期预实验研究结果,在此溶液基础上直接加入去离子水配制质量分数分别为4%、7.7%、11%、14%的甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液,用于甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液抑菌效果的测定。

1.2.2 纳米乳液的形态观察 取经4000 r/min离心30 min后的约5 mL甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液样品,用胶头滴管滴一滴在载玻片上,盖上盖玻片,放在显微镜载物台上于100倍油镜下观察样品的各个部分,并摄制照片。

1.2.3 纳米乳液粒径测定 利用马尔文激光粒径仪在25 ℃下测量柑橘精油纳米乳液粒径。样品用去离子水稀释1000倍,以防止多次散射效应。在塑料比色皿中加入甜橙精油纳米乳液1 mL,插入样品槽中,盖上仓盖。设定测量波长为658 nm,散射角173 °,平衡时间为60 s,间隔时间为10 s,软件自动记录粒径分组数据。根据粒径和数目,绘制其分布图。每个样扫描三次,得平均值。

1.2.4 浊度及pH分析 采用紫外可见分光光度计在600 nm下测定甜橙精油纳米乳液的OD值;用pH计测量甜橙精油纳米乳的pH,以上实验重复三次。

1.2.5 培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基(细菌培养基):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化钠5 g,琼脂1.5%～2%,加蒸馏水定容至1.0 L,调节pH为7.2～7.4,在120 ℃的条件下灭菌30 min,冷却后备用。

麦芽汁琼脂培养基(真菌培养基):麦芽浸粉130 g,琼脂1.5%～2%,加蒸馏水定容至1.0 L,pH为5.8～6.2,在120 ℃的条件下灭菌30 min,冷却后备用。

1.2.6 菌悬液的制备 细菌悬浊液:细菌用牛肉膏蛋白胨培养基斜面在37 ℃下活化24 h,待用。将经活化的细菌从斜面上各挑取一环,于生理盐水中充分打散后,采用平板菌落计数法计数,菌悬液浓度均调至106～107cfu/mL。

霉菌悬浊液:霉菌用麦芽汁琼脂培养基斜面在28 ℃下活化48 h,待用。将经活化的霉菌从斜面上挑取一环,于生理盐水中充分打散后,经显微镜直接计数,霉菌孢子悬液浓度均调至106～107cfu/mL。

1.2.7 最低抑菌浓度(MIC)的测定 参考陈林林等[17]的方法,并稍作修改。配制牛肉膏蛋白胨培养基,倾注于平板上,待其冷却后移取0.1 mL菌液均匀涂布于培养基表面,用镊子将三片直径为6 mm的圆形滤纸片蘸取质量分数为4%、7.7%、11%、14%的甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液,以及甜橙精油及D-柠檬烯轻轻贴在培养皿中,滤纸片之间成正三角形分布,放入恒温培养箱中培养,每个菌做三组平行。细菌培养24 h,真菌培养48 h,测定抑菌圈直径,以最小抑菌圈直径对应的质量分数作为该菌种的MIC。

1.3 数据处理

数据由三次平行实验测定得到的各实验平均值±标准偏表示，并差采用Microsoft Office Excel 2010进行计算,使用SPSS Statistics 19进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 纳米乳液的质量评价

2.1.1 纳米乳液形态观察及离心稳定性 甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液在100倍油镜下呈规则球形,分布较均匀,乳滴粒径大多分布在10～20 nm之间(图1)。离心后的甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液无浑浊、分层现象,透明、体系均一、性质稳定、流动性好。

图1 甜橙精油纳米乳液(A)和D-柠檬烯纳米乳液(B)的显微结构图Fig.1 Microscopic structure of sweet orange essential oil nanoemulsion(A)and D-limonene nanoemulsion(B)

2.1.2 粒径、浊度和pH分析 如表1所示,不同浓度的甜橙精油纳米乳液在600 nm下的吸光值较小,pH变化范围较小,说明所制备的甜橙精油纳米乳澄清透明、pH稳定性好。本文制备的不同浓度甜橙精油的平均粒径范围在8.51～11.65 nm之间,Guerra-Rosas等[18]研究发现精油纳米乳液的抑菌活性与精油的种类有密切关系,而与纳米乳液的粒径关系不大。

表1 不同浓度甜橙精油纳米乳的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of sweet orange essential oil nanoemulsion with different concentrations

2.2 甜橙精油、D-柠檬烯及纳米乳液的抑菌作用

由表2可知,甜橙精油和D-柠檬烯对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)都有较强的抑制作用。大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对甜橙精油和D-柠檬烯非常敏感,抑菌圈直径远远大于15.0 mm。甜橙精油对金黄色葡萄球菌和桔青霉的抑菌圈直径分别为13.0 mm和12.0 mm,属于中度敏感,但D-柠檬烯对它们的抑菌圈直径均为17.0 mm,属于高度敏感。总体而言,D-柠檬烯的抑菌性优于甜橙精油的抑菌性,且对细菌的抑菌效果要比霉菌好。然而,Torres-Alvarez等[19]发现去除部分柠檬烯的浓缩甜橙精油的抑菌活性比未浓缩精油及D-柠檬烯的抑菌活性强,这说明甜橙精油中的其他成分也具有一定的抑菌活性,比如柠檬醛、α-松油醇、α-香茅醛等含氧化合物[20]。Eldahshan等[21]发现不同组织部位的甜橙精油的抑菌活性也存在差异。

最低抑菌浓度(MIC)指在一定条件下能够抑制微生物生长的最低抑菌剂浓度,不同条件下的MIC也不同[22]。结合表2可知,与甜橙精油纳米乳液相比,D-柠檬烯纳米乳液有更强的抑菌效果,这和李巧巧等[11]研究的商用柑橘精油和D-柠檬烯的抑菌作用结果一致。另外,甜橙精油纳米乳液对枯草芽孢杆菌的抑菌作用最强,其次为大肠杆菌(Escherichiacoli),对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)的抑菌作用较弱。陈林林等[6]在研究柑橘皮油抑菌活性时,发现其对多数革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌有较好的抑菌性,对大肠杆菌(Escherichiacoli)效果最好,其次为白色葡萄球菌(Staphylococcuscremoris),对青霉菌的抑制作用并不显著。

表2 不同浓度甜橙精油纳米乳液、D-柠檬烯纳米乳液和甜橙精油、D-柠檬烯的抑菌性Table 2 Antibacterial effects of different concentrations of sweet orange essential oil nanoemulsions,D-limonene nanoemulsions,orange essential oil and D-limonene

甜橙精油纳米乳液浓度为4%和7.7%时,对大肠杆菌没有抑制作用;浓度为11%时,抑菌圈直径为8.7 mm;浓度为14%时,抑菌圈直径为11.7 mm。不同浓度的D-柠檬烯纳米乳液对大肠杆菌均具有抑菌作用,抑菌圈直径由最低浓度(4%)时的10.0 mm升至最高浓度(14%)时的19.0 mm。对于枯草芽孢杆菌,甜橙精油纳米乳液浓度为4%时没有抑菌作用;浓度为7.7%时,抑菌圈直径为6.7 mm;浓度为14%时,最大抑菌圈直径为14.0 mm。不同浓度的D-柠檬烯纳米乳液对枯草芽孢杆菌均具有抑菌作用,抑菌圈直径由最低浓度(4%)时的11.0 mm升至最高浓度(14%)时的23.7 mm。对于金黄色葡萄球菌,甜橙精油纳米乳液浓度为4%和7.7%时没有抑菌作用;浓度为11%时,抑菌圈直径为7.0 mm;浓度为14%时,抑菌圈直径为9.7 mm。李巧巧等[15]研究发现柠檬精油、橙子精油、柚子精油等柑橘精油对细菌、酵母菌、霉菌都有抑菌作用,其中D-柠檬烯的抑菌效果最优,这和本文结果一致。

不同浓度的D-柠檬烯纳米乳液对金黄色葡萄球菌均具有抑菌作用,抑菌圈直径由最低浓度(4%)时的8.0 mm升至最高浓度(14%)时的13.0 mm。对于桔青霉,甜橙精油纳米乳液浓度为4%和7.7%时没有抑菌作用;浓度为11%时,抑菌圈直径为6.7 mm;浓度为14%时,抑菌圈直径为9.0 mm。4%和7.7%的D-柠檬烯纳米乳液对桔青霉没有抑菌作用,浓度为11%时抑菌圈直径为6.7 mm;浓度为14%时抑菌圈直径为12.0 mm。李娅男[23]发现D-柠檬烯纳米乳液对于酿酒酵母的抑菌效果最佳,对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌也非常敏感,但对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差。陈琳琳等[6]研究柑橘精油抑菌活性发现,大肠杆菌和葡萄球菌对柑橘精油高度敏感,抑菌圈直径大于15.0 mm,青霉对柑橘精油中度敏感,抑菌圈直径为14.1 mm。Fisher等[24]研究柠檬烯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等细菌的抑菌性,发现其对金黄色葡萄球菌等没有抑菌作用。

因此,甜橙精油纳米乳液对大肠杆菌的MIC介于7.7%～11%之间;对枯草芽孢杆菌约为7.7%;对金黄色葡萄球菌约为11%;对青霉约为11%。邢旭亚[25]通过扫描电子显微镜观察发现,当供试菌种经过用MIC制备的Nisin及D-柠檬烯复合油凝胶纳米乳处理3 h后,菌体细胞遭到严重的破坏和变形,这说明了纳米乳液体系可增大菌体细胞膜的通透性,使膜结构受到不可修复的破坏。Sugumar等[26]研究发现经过甜橙精油纳米乳处理的微生物细胞在30 min内就失去了生存能力。

3 结论

利用相转变点法制备甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液,采用抑菌圈法和最低抑菌浓度法研究甜橙精油纳米乳液及其主要成分D-柠檬烯纳米乳液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和桔青霉的抑菌作用,得到结果如下:甜橙精油纳米乳液和D-柠檬烯纳米乳液均具有良好的抑菌作用,且D-柠檬烯纳米乳液抑菌效果比甜橙精油纳米乳液的抑菌效果好。甜橙精油纳米乳液对枯草芽孢杆菌的抑菌作用最强,其MIC最小,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和桔青霉的抑菌作用较弱,其MIC较大,抑菌圈直径分别为8.7、7、6.7 mm。甜橙精油纳米乳液对各个菌种的MIC不一样,枯草芽孢杆菌的MIC约为7.7%;其次为大肠杆菌,其MIC介于7.7%～11%之间;对金黄色葡萄球菌和桔青霉抑制作用较弱,均约为11%。