马亚男 张勇 韩双 刘宁 余贤美 翟浩

摘要：炭疽菌属（Colletotrichum）真菌是一类重要的植物病原真菌，能侵染大多数种植作物，引起炭疽叶枯病和根茎腐烂病，使作物减产甚至绝产，造成严重的经济损失。对引起植物炭疽病的各个物种及其分子机制进行详尽描述和分析研究，可为植物炭疽病的防治策略研发提供重要参考依据。本文从基因组学角度，以7种与农业生产联系紧密的炭疽菌属真菌为对象，阐述了近年来炭疽菌属基因家族的扩展；并从碳水化合物活性酶类（CAZymes）、次生代谢物质（SM）和效应蛋白等三个方面进行了总结，展望了炭疽菌属真菌基因组学信息的开发与利用前景，以期利用基因组测序技术和生物信息学分析手段对该类真菌进行更深入地研究。

关键词：炭疽菌属；基因组学；基因家族

中图分类号：S432.4+4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0148-09

Abstract The fungal genus Colletotrichum includes more than 100 species responsible for anthracnose foliar blight and rot diseases of nearly every crop， resulting reduce or even lost production， and subsequently causing serious economic losses. The detailed description and analysis of various species and molecular mechanisms of Colletotrichum can provide important reference for the research of control strategies. In this article， seven Colletotrichum fungi closely related to agricultural production were introduced based on the genomics study， and the expansion of the gene family in recent years were elaborated. We summarized the three aspects of carbohydrate active enzymes， secondary metabolites and effector proteins， and predicted the prospects for the development and utilization of genomics information of Colletotrichum. We would attempt to carry out deeper research and exploration on Colletotrichum by genomic sequencing technology and bioinformatics analysis methods.

Keywords Colletotrichum； Genomics； Gene family

炭疽菌屬包括100多个种，可以引起几乎所有种植作物的炭疽叶枯病和腐烂病[1，2]。由于其分布普遍性、极端破坏性和作为模式病害系统的科学重要性，炭疽菌属真菌已成为国际公认的十大植物病原真菌之一[3]。

炭疽菌属真菌可以引起大量经济作物的炭疽病，比如玉米、豆类、草莓、咖啡、辣椒、葫芦、土豆等[2，4，5-13]。由炭疽菌属真菌引起的水果采后腐烂病也可以造成严重的产量损失，损失率可达100%[14]。炭疽菌属真菌还可以侵染高粱、玉米和木薯等重要的粮食作物[15-17]。

炭疽菌属真菌在植物病理学和真菌学历史上占据着重要的地位。引起豆类炭疽病的C. lindemuthianum是第一个被描述的具有寄主特异性的生理小种[18]，为利用小种差异进行抗病育种工作提供了参考[19]。随后通过豆类炭疽病病害系统加深了对“基因对基因”假说的理解[20，21]。另外，对C. gloeosporioides有性世代的研究是真菌有性生殖研究的开端。在20世纪60年代和70年代，对炭疽菌属的研究始终处于系统诱导抗病性、寄主化学防御系统和植物抗毒素等水平，并且利用炭疽菌属真菌第一次分离纯化获得了激发子[22]，同时还利用炭疽菌属真菌对黑化附着胞的分化和功能进行了详细的阐述[23]。目前已从炭疽菌属真菌中克隆和描述了AMP循环、MAP激酶和钙调信号通路中的基础组件[24-29]。直至今日，炭疽菌属真菌依然被作为重要的模式病原，应用于致病性分子和细胞基础研究和分析[23，30-32]。

对引起植物炭疽病的各个物种及其分子机制进行详尽描述和分析研究，可以为植物炭疽病的防治策略研发提供重要参考依据。

1 炭疽菌属真菌基因组学研究

对具有不同侵染方式的炭疽菌属真菌进行基因组分析，可以帮助我们找到存在共性和保守性的靶标，用于炭疽病的防治。但目前只对少数几个炭疽菌属真菌进行了较深入的分子水平研究，对可以造成粮食和经济作物巨大产量和经济损失的病原菌知之甚少。一个病害系统中单一的研究发现极少可以在其他的系统中得到确认或验证，所以无法总结归纳一套用于所有类群的规律性致病机制。以Magnaporthe oryzae为起点[33]，很多重要的植物病原真菌基因组被测序，而炭疽菌属始终没有成为基因组学革命的主角，主要是因为很难在不了解种间致病模式相关性的前提下，通过对某一个单一物种基因组的测序来代表和描述所有的种；对物种间的分类边界和进化关系认识不足，也限制了我们无法做出最精准的基因组分析。

随着基因组测序技术的不断发展，测序速度越来越快，测序成本越来越低，陆续有20余个炭疽菌属真菌的全基因组被测序[30，34-36]。本篇将简要介绍其中7个与农业生产息息相关的炭疽菌属真菌，根据我们目前对于炭疽菌属分类法的理解，这7个种分别位于炭疽菌属系统发育树的7个不同的复合群/分支[1]。

1.1 Colletotrichum graminicola

C. graminicola菌株M1.001是炭疽菌属中第一个获得完整基因组序列的菌株，同时也是使用桑格双脱氧技术进行测序的菌株之一，属于Graminicola复合群。C. graminicola是目前研究较为透彻同时也较好防治的一个炭疽菌，可以引起玉米（Zea mays）的炭疽茎腐病，该病害极具破坏性，可造成美国玉米年产损失超过10亿美元[37]。

1.2 Colletotrichum higginsianum

C. higginsianum菌株IMI349063可以引起蕓苔属（Brassica）和萝卜属（Raphanus）作物的炭疽病，同时也能侵染世界范围内广泛种植的十字花科植物中的一些种类，属于Destructivum复合群（Graminicola的支序分类分支）。已测序的C. higginsianum菌株最初分离自小白菜（B. chinensis），但也可以侵染和引起拟南芥病害[30， 38]，该现象引起了学者们广泛的科学兴趣[38， 39]。C. higginsianum菌株提供了一个互作实验系统，在该系统中寄主和病原都可以获得转基因材料，尤其寄主方面大量可用的遗传工具和资源，可以帮助分析寄主抗性和敏感性[40， 41]。

1.3 Colletotrichum fructicola

C. fructicola菌株Nara-gc5可以引起草莓（Fragaria ananassa）的冠腐病[42]，在世界范围内造成巨大产量损失。需要说明的是，尽管Nara-gc5菌株早期被认为是C. gloeosporioides，但目前对Gloeosporioides复合群的最新分类法有更精准的鉴定[43]。多基因系统发育树显示，Nara-gc5菌株属于C. fructicola，分布于全球各个角落，到目前已从8个不同的植物家族中分离获得[8，43]。由C. fructicola侵染引起的草莓炭疽病可以造成设施草莓80%的产量损失，露天草莓50%的产量损失[13]。同时C. fructicola还可以侵染很多其他经济作物，如咖啡、苹果、山药、梨和牛油果等[8，43]。对C. fructicola以及Gloeosporioides复合群内各种之间进行比较，可以获得菌株适应特殊寄主以及生活方式的决定因素。

1.4 Colletotrichum orbiculare

C. orbiculare菌株104-T引起的葫芦（Lagenaria siceraria）炭疽病是较为常见同时也较为严重的一种病害，可以在营养组织和果实上引起炭疽病斑[23]。在美国，炭疽病曾一度成为葫芦和瓜类最为常见且破坏性极强的病害。目前，虽然葫芦和瓜类炭疽病所造成的损失已通过优化管理措施等手段得到控制，但炭疽病始终是高湿地区商业种植西瓜（Citrullus lanatus）的重要流行性病害[44]。经基因瞬时表达和基因沉默手段证实，已测序的C. orbiculare菌株同时也能侵染模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）和烟草（N. tabacum）[45]。目前已经构建了C. orbiculare的遗传操作体系，包括基因定向或随机插入突变等。另外，C. orbiculare菌株致病性稳定，从细胞学角度已做了充分的描述，使该真菌成为了较好的研究对象[46]。

1.5 Colletotrichum acutatum

C. acutatum菌株KC05可以侵染世界范围内的多种植物，包括蔬菜、水果、豆类以及多年生树木等[47-50]，尤其可以使一些种植胡椒（Piper Nigrum）的热带和亚热带国家遭受严重的经济损失[10，51-53]。C. acutatum属于Acutatum复合群。研究者从C. acutatum的草莓分离株SA 0-1中克隆并表达了炭疽菌属真菌的第一个倍半萜烯合酶[47]，该酶可以参与合成多种倍半萜烯化合物，其中主要的产物是石竹烯。倍半萜类化合物作为一种生物活性代谢物质，在病原-寄主互作过程中发挥着重要的作用[54，55]，同时在农药和医药研发中具有广泛的应用前景[56]。

1.6 Colletotrichum incanum

C. incanum菌株MAFF238712最初分离自日本白萝卜（R. sativus），属于Spaethianum复合群，与Graminicola分支和Destructivum分支亲缘关系较近。研究证实，C. incanum既可以侵染单子叶植物（如拟南芥）[34]，也可以侵染双子叶植物，如大豆（Glycine max）、百合（Lilium brownii）[34，57]。C. incanum的基因组分析为真菌适应单子叶植物和双子叶植物寄主的研究提供了有趣的模式系统[34]。

1.7 Colletotrichum truncatum

C. truncatum菌株MTCC3414分离自红辣椒（Capsicum annuum），属于Truncatum复合群。红辣椒在墨西哥具有重要的经济作用，虽然C. acutatum和C. gloeosporioides也能引起红辣椒的炭疽病[58]，但C. truncatum是引起东南亚国家红辣椒炭疽病的主要病原真菌[10，59]。C. truncatum基因组序列分析揭示了大量的致病相关基因，包括编码分泌蛋白质的基因、效应蛋白基因、植物细胞壁降解酶基因和次生代谢相关蛋白质基因以及与寄主特异性侵染机制相关的潜在基因等。

2 炭疽菌属真菌基因家族的扩展

相对于已经进行了全基因组测序的其他子囊菌，在炭疽菌属真菌的基因组中，有若干个基因家族得到扩展。扩展涵盖的预测基因可编码SM、CAZymes和效应蛋白等[30，34]。

在植物-真菌互作过程中，包括从寄主植物中获取养分或诱导寄主细胞过敏性坏死等，真菌的分泌蛋白发挥着重要作用[60，61]。通过对炭疽菌属真菌分泌蛋白质组的预测和注释，发现其数量巨大、种类繁多。其中C. fructicola基因组含有2 356个分泌蛋白基因，占所有蛋白基因的15%，最少的C. graminicola基因组中分泌蛋白基因也达到了1 650个之多，占整个蛋白质组的14%，相当于其他盘菌亚门（Pezizomycotina）真菌所有预测蛋白质的数量[60]。有研究证实，半活体营养型病原真菌基因组中分泌蛋白基因占很大比重，往往大于10%[61]，炭疽菌属很好地印证了这一点。目前的基因组数据分析显示，有极大一部分分泌蛋白在各个炭疽菌属真菌中是共享的，其他小部分存在物种特异性。

总的来说，通过基因组测序分析，相比于活体营养型真菌，半活体营养型的炭疽菌属真菌与死体营养型真菌更相似，具有SM和CAZymes扩展的基因家族。炭疽菌属真菌可以产生大量的、种类繁多的降解酶类和次生代谢物质以及可以诱导细胞死亡的毒力效应蛋白，这些与死体营养型真菌极为相似。但同时，炭疽菌属真菌也可以编码大量的多种多样的小分子特异性分泌效应蛋白，这又与活体营养型真菌存在共性。我们认为，在炭疽菌属真菌不同的生活和侵染阶段，是不同的基因表达模式和分子机制在发挥作用，以达到成功侵染寄主的目的。

2.1 碳水化合物活性酶类

被获得充分扩展的能够降解植物细胞壁组成成分纤维素和其他多糖的CAZymes，是炭疽菌、稻瘟病菌、镰刀菌等半活体营养型与死体营养型植物病原真菌的共同特征[33，62，63]，同时也是炭疽菌属真菌基因组的标志性特征。这些蛋白质在炭疽菌中的总体丰度是迄今已测序的任何子囊菌都无法比拟的，即便是具有极高破坏性的死体营养型的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）或核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）[30，34，64]。

在双子叶植物叶片中，果胶约占细胞壁的35%，而玉米等单子叶植物的细胞壁通常只含有10%的果胶[65]。侵染双子叶植物的C. higginsianum、C. fructicola、C. orbiculare的基因组可以编码大量的果胶酶，反映了这些真菌重要的寄主适应性特征。特别是C. orbiculare和C. fructicola分别可编码超过100种不同的果胶酶，大大超过其他已测序的真菌基因组。研究发现，C. graminicola的基因组所具有的果胶酶基因相对较少，平均比侵染双子叶植物的物种少46%。与果胶酶总体丰度相一致，死体营养阶段的基因表达谱显示，C. higginsianum調用了51种果胶酶之多，而C. graminicola只表达了16种果胶酶[30]。

2.2 次生代谢物质

炭疽菌属真菌基因组中另一类高度扩展的基因，推测可编码SM。SM多为小分子，对生物体的生长和存活不是必需的，但对于环境的适应是非常重要的。这些代谢产物的生成往往与通过对其他生物的毒性和/或抑制作用从而成功竞争到宿主资源有关[66，67]。研究证实，以这种形式发挥作用的SM很多，包括禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的单端孢霉烯基因簇以及侵染番茄的链格孢菌（Alternaria alternate）的AAL毒素簇[68]。死体营养型植物病原真菌的基因组中包含大量的SM相关基因[64]，其中一部分SM常常被认为是具有直接致病性作用的植物毒素[69]。相反，活体营养型真菌的基因组中SM相关基因相对较少，比如禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis）[70]和玉米黑粉菌（Ustilago maydis）[66，71]等。

目前关于SM在半活体营养型植物病原真菌中的作用知之甚少[72，73]。炭疽菌属真菌可产生多种SM，已报道的包括黄酮类、肽类和萜烯类，以及聚酮化合物衍生的1， 8-二羟基萘（DHN）黑色素等，这些对于附着胞的宿主渗透作用是必需的[74]。其他例子包括：从C. gloesoporiodes中分离得到的铁载体铁蛋白[75]，从C. nicotianae中分离得到的炭疽菌素A、B、C[76]，以及C. gloesoporiodes产生的具有抗氧化性质的四羟基化合物[77]。目前已对来自C. graminicola的几种次生代谢物质进行了描述，包括抗真菌化合物根赤壳菌素[78]以及孢子萌发抑制剂菌胞素-丙氨酸[79]。也有研究报道称，敲除PPT1基因会导致C. graminicola的致病性下降，该基因可编码所有聚酮化合物合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）的酶促功能所必需的辅因子，肯定了SM在玉米致病过程中发挥着重要作用的观点[80]。还有研究表明，包括C. gloesoporiodes在内的很多炭疽菌属真菌能够合成植物生长素，其在病原-寄主互作过程中可能发挥着重要的作用[81]。炭疽菌属真菌的基因组中都可能含有针对生长素的合成与代谢途径进行调控的基因[30，34]。

在所有的真菌中，SM相关基因更倾向于成簇存在，这些基因簇常常还包含额外的酶、细胞色素P450基因、转录因子基因和转运蛋白基因等[67]。从炭疽菌属真菌中预测获得的SM基因簇的数目非常高，低至C. orbiculare的42个基因簇，高至C. fructicola的56个基因簇。这种SM基因簇的丰度比至今已进行全基因组测序的其他植物病原真菌大得多[30，34]。但是炭疽菌属真菌的SM基因簇大多保守性不高。

2.3 效应蛋白

相比子囊菌的其他已测序物种的基因组，可以侵染双子叶植物的炭疽菌属真菌基因组中含有更多的分泌蛋白酶，尤其是在其他病害系统中也作为效应蛋白的被称作枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶[82]。通过类似这种蛋白质数量、性质和功能的比较分析，我们可以更深入地了解各个炭疽菌属真菌的寄主特异性。

炭疽菌属真菌的分泌蛋白质组中包含很多其他病原真菌致病性效应蛋白的同源物，比如可诱导寄主组织坏死的蛋白质[83-85]，M. oryzae中活体营养相关蛋白BAS2和BAS3[86]等。在C. higginsianum基因组中发现了可以编码类坏死/乙烯诱导肽（NEP）Ⅰ蛋白家族的多个基因，其中有3个可以诱导本氏烟细胞死亡[87]。Yoshino等[88]通过对C. orbiculare诱导本氏烟细胞死亡的蛋白质筛选，找到了由初生菌丝分泌的NIS1蛋白，NIS1与寄主的热休克蛋白90（Hsp90）相互作用介导寄主细胞死亡的过程，是重要的R基因介导的过敏性坏死反应（HR）[89]。在其他炭疽菌属真菌的基因组中，同样存在NIS1效应蛋白的同源物。Stephenson等[90]通过对C. gloeosporioides氮饥饿菌丝EST库的筛选，获得了一个CgDN3基因，该基因可以编码一个小分子分泌蛋白，在病原成功定殖柱花草（Stylosanthes guianensis）叶片的过程中发挥着重要的作用。侵染过程中，CgDN3在活体营养阶段的囊泡中大量转录聚集，快速诱导寄主细胞死亡，而敲除CgDN3的突变株无法侵染寄主或不能分化形成初侵染结构。在已测序的炭疽菌属真菌基因组中，有的含有CgDN3同源基因，有的不含有该基因。另一个炭疽菌属真菌保守的分泌效应蛋白是Nudix水解酶，Bhadauria等[91]在C. truncatum中克隆获得该水解酶基因CtNudix，对该基因进行过量表达可以诱导菌株侵染位点的细胞死亡和致病力的丧失。在本氏烟中的定位研究显示，CtNudix蛋白作用于植物的细胞膜，说明它可以通过影响细胞膜的稳定性从而改变细胞的完整性。包括M. oryzae和致病疫霉（Phytophthora infestans）在内的很多半活体营养型病原真菌均可表达Nudix效应蛋白同源物，说明了其在侵染过程中的重要地位。

与子囊菌中其他真菌的基因组相比，炭疽菌属真菌的基因组均包含一个扩展的基因家族，这个家族基因编码的蛋白质都含有CBM50碳水化合物结合结构，或者称为LysM结构域。这些基因具有高度的特异性，并且进化迅速。他们可以通过结合真菌细胞壁的几丁质以规避寄主对活体营养菌丝的识别[92]。目前已有研究利用单克隆抗体在C. lindemuthianum中筛选获得了定位于活体营养菌丝的LysM蛋白CIH1[93，94]。所有炭疽菌属真菌基因组中均含有CIH1同源基因。

活体营养型植物病原真菌都可以产生大量的效应蛋白，这些效应蛋白往往都是些小分子分泌蛋白（SSP），抑制寄主的防卫反应并重新编程寄主细胞以适应病原，从而帮助建立病原与寄主的互作关系[95]。這些SSP效应蛋白均少于300个氨基酸，并且富含半胱氨酸，同时具有物种特异性[96]。所有炭疽菌属真菌基因组注释中均含有许多候选SSP效应蛋白，其中有很多富含半胱氨酸并且/或者存在物种特异性。值得注意的是，在454焦磷酸测序技术出现以后，又发现了大量C. higginsianum的推测效应蛋白[87]，其数量是早期测序技术获得数据的四倍之多。据此我们不难推测，本篇中提到的7个炭疽菌属基因组中注释的效应蛋白可能只是冰山一角。

3 炭疽菌属真菌基因组学信息的开发与利用 目前对于炭疽菌属真菌的研究已到了后基因组时代。随着测序技术的不断发展，我们感兴趣的基因组或转录组数据可以高效率、高质量的获得，测序成本也越来越低。到目前为止，已经有20余个炭疽菌属真菌获得了全基因组序列，并且还有很多的测序工作正在进行中。基因组学和转录组学的联合研究策略为植物病原学研究提供了更多的思路和角度，更重要的是，比较转录组学分析策略在相同侵染环境和阶段中，不同研究对象的比较是必不可少的。为了更好地对转录组进行比较，如需要研究初生菌丝在活的和死的寄主细胞内的定殖从而找到各处理间的差异，常需要使用单细胞抽样法，例如FACS或者LCM等[87， 97， 98]。详细的细胞学和生物学研究对于每一个新物种的分析来说都是十分必要的，然后再进一步考虑相关的生物信息学和基因组测序技术的应用。在对使用不同的测序技术、拼接方法和注释软件分析的基因组信息进行直接比较时需格外谨慎，比较获得的差异需与人工注释的结果相一致。

炭疽菌属真菌具有较广谱的致病性和多种多样的侵染方式，使我们有了更多的机会利用比较基因组学和转录组学技术，从分子和进化角度对其侵染方式进行分析和研究。比如，可以对炭疽菌属中具有极端生活方式的物种进行比较分析，阐明活体营养型和植物内生型物种是如何由半活体寄生型分化而来；可以对预测基因（蛋白酶基因、植物胞壁降解酶基因、特异蛋白基因和次生代谢效应蛋白基因等）进行比较分析，了解各个基因发挥作用的关键生命时期；可以对侵染同一寄主的不同寄生方式的物种进行比较（内生型vs致病型，死体营养性vs半活体寄生型等）；也可以对侵染同一寄主植物不同器官的病原菌进行比较分析。

目前已对多个炭疽菌属真菌的致病相关基因和病原相关分子模式（PAMPs）进行了预测，很多问题开始显现，所以对于这些种类繁多的物种，我们还有很多工作要做。我们期望通过对保守组件和机制的研究探索，为炭疽病的化学防治和抗病育种工作提供可靠的靶标和思路。目前亦有很多从基因组学角度对炭疽菌属真菌寄主特异性的研究，包括植物胞壁降解酶的特殊适应性和应对不同寄主细胞壁组成的基因表达模式，以及次生代谢物质和分泌效应蛋白的多样性等。很多的效应蛋白存在种间特异性，但是也有很多在属内或与其他属间存在保守性，这些发现可以说明某些效应蛋白保守的功能和寄主靶标。目前我们需要做的就是验证这些存在保守性和特异性的效应蛋白，阐明这些效应蛋白调控寄主细胞产生诱导抗病性的分子机制。

4 結论

长久以来，我们主要采用种植抗病品种的方式控制炭疽病的不断扩展，但由于病原群落可以很快适应传统的抗病基因调控的抗病策略，因此这种方法的效果往往不能长久显现，最终导致抗真菌剂的使用越来越多、越来越频繁[99， 100]。尤其是由炭疽菌属真菌造成的蔬果采后病害，更需要很多高毒性、高成本的化学药剂[14]。未来的研究工作中，我们将要利用以基因组学和转录组学为基础的技术手段，对炭疽菌属中各个物种的保守组件进行分析研究，为病害防治和抗病育种提供长效的应对策略。目前很多的研究证实，可以利用病原效应蛋白作为分子探针，筛选鉴定寄主的感病基因[101]。感病基因编码蛋白被病原真菌识别，引起病原菌扩散并最终导致植物组织病害。如果使植物感病基因失活，则可以降低病原菌的致病能力，诱导寄主产生持久的抗病性[102]。数十年来，多项研究证实了这一点，以植物感病基因为基础产生的免疫反应，可以抵御多种病原菌的侵染[101]。虽然植物感病基因为植物抗病性研究提供了很多有效材料，但是目前获得验证和应用的微乎其微。而基因组学的不断发展和壮大及更多候选研究目标的发现，将为炭疽菌属“效应蛋白-靶标”的互作研究探索提供重要的技术支持和材料资源。

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