刘春晓 李会海 马兰 董瑞 刘强 何春梅 关海英 刘铁山 汪黎明

摘要：利用SSR标记对144份玉米自交系遗传多样性进行研究，初步进行了杂种优势群划分。从224对SSR引物中筛选出90对扩增带型稳定且具有多态性的引物，从供试材料中共检测到424个多态性位点，每个SSR标记的等位基因数为2～10個，平均为4.71个；多态性信息量为0.11～0.82，平均为0.53。利用UPGMA方法将144份自交系划分为2大类，5个亚群，分析结果与系谱分析基本一致。

关键词：玉米自交系；SSR标记；遗传多样性；杂种优势群

中图分类号：S513.03 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0001-06

Abstract Genetic diversity of 144 maize inbred lines was studied by SSR markers， and the heterotic groups were preliminarily classified. Ninety pairs of primers with stable and polymorphic bands were screened from 224 pairs of SSR primers. A total of 424 alleles were detected out from the tested materials. Two to ten alleles per SSR marker were detected out， and the mean was 4.71. The polymorphism information content （PIC） for the SSR loci varied from 0.11 to 0.82 with the mean of 0.53. The 144 inbred lines were divided into 2 groups and 5 subgroups by UPGMA method. The analysis results were consistent with the pedigree analysis.

Keywords Maize inbred line； SSR marker； Genetic diversity； Heterotic group

玉米杂种优势类群划分和杂种优势模式构建是玉米自交系选育和杂交组合组配的重要依据，对提高玉米育种效率具有重要意义。20世纪80年代以来，育种家利用形态标记、细胞学标记、配合力表现[1]以及系谱分析等方法[2]进行了类群划分，但由于人工选择和遗传漂移的作用及系谱资料的不完整性等原因，这些方法在进行遗传变异分析时均表现出了一定的局限性[3]。近年来，分子标记技术快速发展，为自交系杂交优势群的划分提供了一定的分子学依据，使划分结果更准确。国内外学者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子标记分别对亲缘关系明确的玉米材料进行杂种优势群划分，所得结果与系谱资料基本吻合[4-7]。

SSR标记是建立在PCR反应基础之上的一种遗传标记，以多态性丰富、共显性遗传、重复性高、稳定可靠、操作简单等优点，被广泛应用于玉米种质的遗传多样性研究[8]。李新海[9]和袁力行[10]等均将SSR标记应用于玉米自交系的遗传变异研究，划群结果与其系谱关系基本一致。本研究利用90对SSR引物研究了144份玉米自交系的遗传多样性，旨在对新选、引育的优良自交系进行杂种优势群划分，为种质改良、扩增和创新及杂交组合的亲本选配提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

所选用的144份玉米自交系由山东省农业科学院玉米研究所提供，该自交系均为连续多代自交，性状稳定（表1）。

1.2 SSR标记分析

1.2.1 DNA提取 采用混合取样法从每份玉米自交系的植株上剪取幼嫩叶片，采用CTAB法[11]提取基因组DNA，用NaNoDRop 2000分光光度计检测DNA质量和浓度，并把浓度调至50 ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 SSR引物筛选 从MaizeGDB和文献中选择均匀分布在玉米10条染色体上的224对SSR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，再通过电泳从中筛选出带型稳定、多态性高的引物用于试验。

1.2.3 PCR和电泳检测 采用10.0 μL反应体系，包括Mix 5.0 μL，10 ng/μL引物各0.2 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 3.6 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒电压120 V，电泳4 h左右，银染检测。

1.3 数据统计分析

SSR扩增产物以0、1统计建立数据库。在相同迁移率位置上，有带者记为1，无带者记为0。按Smith等[12]提供的公式计算SSR位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC），即PIC =1-Σf2i，其中fi为i位点的基因频率。按UPGMA （unweight pair group method arithmetic averages）方法进行聚类分析。所有数据处理均由NTSYS-PC2.10e和Microsoft Excel软件完成。

2 结果与分析

2.1 SSR标记分析结果

首先利用224对SSR引物对8份自交系进行同源位点扩增，从中选取扩增条带清晰且有多态性的90对引物对144份自交系进行扩增。在供试自交系中，多数仅扩增出1条片段，也有些引物能在几个自交系中扩增出2条片段，如引物umc1186（图1）在第8、17和24泳道中均扩增出2条带，这可能是由于此引物与玉米基因组存在2个结合位点等因素有关。这90对引物均匀分布于玉米的10条染色体，在供试材料中共检测出424个等位基因，每对引物检测出2～10个等位基因，平均每个位点的等位基因数为4.71个，其中phi233376引物变异程度最高，检测出10个等位变异，而umc2240、nc133、phi058、umc2197、phi121引物多态性最差，仅有2个变异位点（表2）。表明这些SSR标记具有较为丰富的遗传多样性。

多态性信息含量（PIC）与等位基因变异数目相互对应，等位基因变异较多的SSR引物具有较高的PIC值。由表2可知，90对引物位点的平均PIC值为0.53，其中umc1034位点的PIC最大0.82，而umc2137位点最小0.11。说明SSR标记具有高度的变异性。

2.2 144个自交系的类聚划分

利用424个多态性SSR标记计算144份自交系之间的遗传相似系数（GS），按UPGMA 方法对供试自交系进行聚类。由图2可知，以遗传距离0.75为阈值，可以将144份材料划分为2个类群。

第一大类包括20个自交系：CML499、CML176、CML321、CML491、CML444、CML405、CML448、TG001-2、CML161、齐3925、齐319、CML453、CML445、鲁原92、CML412、CML408、CML496、CML426、Y011、Y022。该类自交系遗传背景较复杂，普遍含有国外种质资源遗传背景，如含字母“CML”的自交系均引自墨西哥国际小麦玉米改良中心，齐319为国外杂交种78599选系，齐3925为齐319衍生系。

第二大类主要是国内种质，可归类为4个玉米杂种优势群，结合自交系已知系谱来源、生物学性状、配合力测定及SSR标记分析可分析出代表性自交系：

第1群包括21个自交系：Y001、Y072、M54Z、M54、Y021、Y108、鲁系4507、鲁系4502、Lz3123-1、鲁系4508、Lz3123-2、Lx4201、鲁自1510-2、PH4CV、鲁自1510、JH721、Y024、Y16-12、Y030、Y078、Y034，同属Lancaster杂种优势群，以自交系PH4CV为代表性自交系。

第2群包括39个自交系： Lz1140-01、Lz1140-02、Y015、Y012、Y014、Y013、Lz08-11 、Y027、Lzd01-1、835、Y075、Y119、Y117、Y118、Lz11、Y033、Y035、Y042、Y055、Y059、Y052、PH6WC、Y079、Y062、Y114、Y106、Y105、Y107、Lz438-12、Y080、Lzd01-2、Y086、Lz960-11、Lz3111、WYS、Lz964-11、Lz956-31、Lz044-12、Lz047-13，屬Reid杂种优势群，以PH6WC为代表性自交系。

第3群包括32个自交系：Y002、9648、WK858、Lz8558、Y081、郑58、Y123、CT03、Y124、Y087、Y088、E003、Y046、Y054、Y064、Y025、Y103、Y112、Y048、858、Y053、Y121、L239、Lx6949-2、Lx6949-1、Y066、Lz58p1、Lx6958、鲁系4958、Y067、Y006、Y026，属改良Reid杂种优势群，以郑58为代表性自交系。

第4群包括32个自交系：Y005、Y010、Y028、昌7-2、LP1201、浚92-8、Y061、Y029、Y082、798-1、Y127、Y077、Lz9892、Lx03-2、Lx9801、Lz2192、Lz9321、Lx2111、Qxh0121、Lz2193、Lz7211、Lx2318、Y125、Lx2311、Lx2314、Lx2316、鲁系9311、Lx2317、Y008、Y050、京24、K12，同属SPT杂种优势群，以昌7-2与Lx9801为代表性自交系。

3 讨论与结论

我国作为玉米生产大国，有着丰富的玉米种质资源。研究现有种质资源的遗传多样性，对正确认识我国玉米种质资源基础，提高其利用效率具有重要的意义。本研究通过将SSR分子标记数据与自交系已知系谱来源、生物学性状、配合力测定等相结合，对育种实践工作有如下指导意义：一是可对国外自交系和遗传背景不详的自交系进行归类；二是对以杂交种为基础育成的自交系，可确定其与父母本的遗传距离远近；三是分析种质资源的遗传多样性，探寻拓展遗传基础的方向与途径。分析试验材料和试验结果可知，以郑58为代表的改良Reid群和以昌7-2与Lx9801为代表的SPT群仍是黄淮海夏玉米区的主导种质；近年来随着先玉335等美系杂交种的大面积推广，以PH4CV为代表的Lancaster群和以PH6WC为代表的Reid群也上升为主导种质；以郑58为代表的改良Reid群自交系和以PH6WC为代表的Reid群自交系进行比较，其遗传距离和表观性状存在着明显差异；PB群种质因为生育期偏晚、出籽率低、脱水慢等缺陷，应用的数量和影响力呈现明显的下降趋势，但随着高温、病害等生态逆境的高频发生，仍有必要选择优良的PB群种质来改良主导种质的抗逆性；持续引进和鉴定出与当前主导种质遗传距离较远的优良新种质，是拓展种质基础和创新种质的重要渠道，而如何高效利用这些新种质也是育种者需要攻克的重要研究课题。

PIC是衡量DNA标记位点变异程度高低的重要指标，群体的平均PIC 值越高，DNA 标记位点变异程度越高，群体的遗传多样性就越丰富[13]。Warburton等[14]利用85对SSR引物研究7个CIMMYT群体和57个自交系的遗传多样性，57个自交系平均每个位点的等位基因是4.9个，在群体中每个位点是6.3个，也就是说用250个等位基因就足以揭示这些复杂群体的遗传变异。在本研究中，所选用的90对SSR引物均匀地分布于玉米10条染色体上，在144份自交系间共检测出424个等位基因变异，每对引物检测出2～10个等位基因，平均为4.71个；多态性信息量为0.11～0.82，平均为0.53。这主要是由于本研究中所选引物数量较多，均匀分布于玉米各条染色体上，且应用的聚丙烯酰胺凝胶分辨率较高，这样更好地揭示了不同自交系间的遗传差异，从而提高了多态性信息量[15]。

在育种实践中，可充分利用分子标记技术对玉米常见自交系和新自交系进行杂种优势群划分。分子标记技术只有与田间观测相结合，才能起到更好、更准确的育种指导作用。

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