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(天津科技大学食品工程与生物技术学院,食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457)

紫外辐射(ultraviolet radiation,UVR)是太阳辐射的一部分,其辐射能占太阳总辐射的3%～5%。随着全球气候的暖化,导致大气平流层臭氧减少,到达地表的UVR也逐渐增强,这对全球生态环境和人类健康产生了重要影响[1-2]。研究表明,过度的UVR会引起机体DNA损伤、诱导细胞凋亡,甚至导致皮肤癌的发生[3-5]。通常采用减少阳光暴晒、涂抹防晒霜和穿戴防护服等方法以降低UVR导致皮肤癌的发生。而近年来,从天然产物中筛选具有抗UVR功能的物质的研究越来越受到人们的关注[6-8]。研究表明,水飞蓟素(silibinin)、绿茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)、红茶浸提液(black tea infusion)、红茶茶黄素(black tea extract theaflavins)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)等天然产物都具有良好的抗UVR引起的皮肤癌的作用[9-12],而这些物质一般都具有抗炎、抗氧化、DNA修复和免疫调节等生物活性[13-14]。

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是生物体内分布最广泛且具有重要生物活性的一种omega-6多不饱和脂肪酸,具有免疫调节、抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤和保护皮肤等多种生理活性[15-17]。但目前有关AA抗UVR的研究尚未见报道。本文通过不同剂量的UVR照射秀丽隐杆线虫,建立秀丽隐杆线虫的UVR损伤模型,考察AA对秀丽隐杆线虫UVR损伤的保护作用,为AA在抗UVR药品或功能食品中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

N2野生型秀丽隐杆线虫(雌雄同体) 由北京生命科学研究所王晓晨研究员惠赠;E.coliOP50:为尿嘧啶合成缺陷性菌株(不含任何抗性) 由CaenorhabditisGeneties Center(University of Minnesota,CGC)惠赠;五氟尿嘧啶(5-Fu) 美国Sigma公司;花生四烯酸(AA纯度98%) 武汉欧米嘉生物医药有限公司;琼脂粉、胰蛋白胨、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙醇等 均为国产分析纯。

LB培养基、NGM培养基、线虫液体培养(S-Medium)的配制参照张媛[18]的方法。

M9缓冲液:KH2PO43 g,Na2HPO46 g,NaCl 5 g,MgSO40.12 g,加入蒸馏水至1 L,121 ℃高压灭菌20 min。

LDZH-100KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;HPS-160型生化培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;PXS-104连续变倍体式显微镜 天津市欧诺仪器仪表有限公司;UVC500-230V型紫外交联仪 美国Hoefer;TS100型X倒置荧光显微镜及照相系统 日本Nikon公司;FE20K型酸度计 梅特勒托利多仪器公司;TGL-18000CR型高速低温离心机 上海安亭科学仪器厂;MDF-U33V型-80 ℃冷冻冰箱 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 秀丽隐杆线虫的基本培养 参照Brenner S[19]、王晋[20]等人的方法,秀丽隐杆线虫置于涂布有E.coliOP50的标准线虫培养基(NGM)中,20 ℃下培养;E.coliOP50采用LB液体培养基培养。

1.2.2 秀丽隐杆线虫的同期化处理 参照Portadelariva[21]、Wan[22]等人的方法对秀丽隐杆线虫进行同期化处理。

1.2.3 秀丽隐杆线虫的UVR处理 将同期化的秀丽隐杆线虫培养至L4期,收集并用线虫液体培养基(S-Medium)冲洗虫体3次,转移至NGM培养板中,保证虫体无交叠的情况下,在紫外交联仪中以不同的剂量(0、2、4、5、6、7、8、10 MJ/cm2)UVR处理30 d。

1.2.4 秀丽隐杆线虫给药处理 将UVR处理后的秀丽隐杆线虫分别挑至涂布有不同浓度AA的NGM培养板中(含有12.5 mg/L的5-Fu),20 ℃下培养24 h。每个浓度作3个平行,空白对照以M9缓冲液进行涂布。

1.2.5 秀丽隐杆线虫寿命的测定 将1.2.3或1.2.4处理后的秀丽隐杆线虫转入涂有E.coliOP50的NGM培养板上,20 ℃下培养,每组作3个平行,每个平行20条秀丽隐杆线虫,每天进行观察并计数。如用挑针轻触秀丽隐杆线虫虫体,无反应,即判定线虫死亡。所有受试秀丽隐杆线虫从UVR处理或给药处理后转入NGM培养基上的开始时间记为第0 d。致死率的计算公式如下:

1.2.6 秀丽隐杆线虫虫体运动能力的测定 将1.2.4中给药处理后的秀丽隐杆线虫转入涂有E.coliOP50的NGM培养板上,20 ℃培养48 h,挑取状态相当的秀丽隐杆线虫置于无E.coliOP50的NGM培养基上,自由运动约2 min后,记录秀丽隐杆线虫在20 s内虫体弯曲的次数作为虫体运动能力的指标。每个浓度作3个平行,每个平行30条秀丽隐杆线虫,实验重复3次。

1.2.7 秀丽隐杆线虫产卵数的测定 将15条经过给药处理且生长状态相当的秀丽隐杆线虫挑至新的涂有E.coliOP50的NGM培养板上,每个NGM培养板上培养1条,每24 h转移1次,直至秀丽隐杆线虫产卵期结束。产卵后的培养板20 ℃下培养24 h后记录子代数目。每条秀丽隐杆线虫在产卵期产卵的总和即为该秀丽隐杆线虫的产卵数。每个浓度作3个平行,实验重复3次。

1.2.8 秀丽隐杆线虫细胞内活性氧(ROS)含量的测定 将1.2.4中给药处理后的秀丽隐杆线虫转入涂有E.coliOP50的NGM培养板上,20 ℃培养48 h,用M9缓冲洗涤2次后,转移至含10 μmol 2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)的1 mL M9缓冲液中,20 ℃静置10 min,琼脂糖固定秀丽隐杆线虫,观察并用荧光显微镜拍摄秀丽隐杆线虫二氯荧光素(DCF)荧光图像(激发波长488 nm,发射波长510 nm)。

1.2.9 数据处理 采用统计学方法处理数据,实验平行重复3次,结果以平均值±标准差的形式表示,组间差异显著性用SPSS 13.0软件经t检验分析。

2 结果与分析

2.1 UVR对秀丽隐杆线虫寿命的影响

不同UVR剂量对秀丽隐杆线虫寿命的影响如图1所示。由图1可知,在0～10 MJ/cm2的照射剂量范围内,随着UVR剂量的增加,秀丽隐杆线虫的致死率也逐步提高,当UVR的剂量为10 MJ/cm2时,在第4 d致死率就达到了100%。2、4、5 MJ/cm2处理组与0 MJ/cm2对照组相比,线虫致死率达到100%所用的时间差异不大;而6、7、8 MJ/cm2处理组所用的时间差异较大,所以选择中间剂量的UVR,即7 MJ/cm2进行后续研究。结果表明,UVR会缩短秀丽隐杆线虫的寿命,UVR剂量越大,寿命越短。已有研究表明,短时低剂量的UVR会引起机体老化,褶皱增多,但随着剂量的增加和时间的延长,则会引起生殖细胞凋亡和诱导DNA损伤,进而导致其死亡[23]。这与本文研究的结果相一致。

图1 不同UVR剂量对秀丽隐杆线虫寿命的影响Fig.1 The effect of different doses of UVRon the lifespan of C.elegans

2.2 AA对UVR后的秀丽隐杆线虫寿命的影响

不同浓度的AA对UVR后秀丽隐杆线虫寿命的影响如图2所示。由图2可知,与空白组(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,秀丽隐杆线虫经7 MJ/cm2剂量的UVR处理后,经不同浓度AA(25～200 μmol/L)干预之后秀丽隐杆线虫的致死率均有所降低,其中50 μmol/L的AA降低秀丽隐杆线虫致死率的效果最好,其次为100、25和200 μmol/L。结果表明,AA可以延长秀丽隐杆线虫的寿命,但并不是简单的浓度依赖性。由于AA及其代谢产物生物化学性质的复杂性,AA既具有抗氧化、抗肿瘤等生物活性,但也可以通过氧化应激、离子通道激活、线粒体损伤等途径诱导细胞凋亡[24],因此,AA延长秀丽隐杆线虫寿命的作用机制还有待于进一步深入研究。

图2 不同浓度AA对UVR后的秀丽隐杆线虫寿命的影响Fig.2 The effect of different concentrations of AA on the lifespan of C. elegans after UVR

2.3 AA对UVR后的秀丽隐杆虫运动能力的影响

不同浓度的AA对UVR后秀丽隐杆线虫运动能力的影响如图3所示。由图3可知,7 MJ/cm2剂量UVR处理后的秀丽隐杆线虫,经不同浓度的AA(25～200 μmol/L)干预之后其运动能力均有所提高。与对照组(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,50 μmol/L和100 μmol/L AA浓度组秀丽隐杆线虫的虫体运动能力极显著提高(p<0.01)且50 μmol/L时运动能力较0 μmol/L提高了63.6%,25 μmol/L AA浓度组显著提高(p<0.05),但200 μmol/L AA浓度组却没有显著性差异。结果表明,AA可以改善UVR处理后的秀丽隐杆线虫的运动能力,但与AA的浓度不呈正相关,这可能也与AA及其代谢产物生物化学性质的复杂性有关。

图3 AA对UVR后秀丽隐杆线虫运动能力的影响Fig.3 The effect of AA on the bending frequency of C. elegans after UVR注:与对照组(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 AA对UVR后秀丽隐杆线虫产卵能力的影响

不同浓度的AA对UVR后秀丽隐杆线虫产卵能力的影响如图4所示。由图4可知,7 MJ/cm2剂量UVR处理后的秀丽隐杆线虫,经25～200 μmol/L浓度范围的AA干预之后其产卵数均有所提高,且随着AA浓度的增加呈现先增加后降低的趋势。与对照组(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,100 μmol/LAA浓度组秀丽隐杆线虫的产卵数显著提高(p<0.05),50 μmol/L AA浓度组极显著提高(p<0.01),相比0 μmol/L产卵能力提高了96.6%。结果表明,AA可以增加UVR处理后秀丽隐杆线虫的产卵数,提高其生殖能力,但与AA浓度也不呈正相关。

图4 AA对UVR后秀丽隐杆线虫产卵数的影响Fig.4 The effect of AA on the oviposition rate of C. elegans after UVR注:与对照组(0 μmol/L+7) MJ/cm2相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.5 AA对UVR后秀丽隐杆线虫细胞内活性氧(ROS)荧光强度的影响

DCF的荧光强度可以反映细胞内ROS的水平,荧光越强,细胞内ROS的水平就越高。同时,寿命的长短也与细胞内ROS水平的高低有着紧密的联系,ROS水平越高,某些疾病的发生的机率也越大[25]。AA对辐射后线虫体内ROS荧光强度的影响如图5所示。由图5可以看出,7 MJ/cm2UVR处理组(b组,0 μmol/L+7 MJ/cm2)秀丽隐杆线虫体内的荧光强度最高,其次是50 μmol/L AA给药组(c组,50 μmol/L+7 MJ/cm2),而空白组(a组,0 μmol/L+0 MJ/cm2)荧光强度最低,因此,秀丽隐杆线虫细胞内活性氧水平b组最高,c组次之,a组最低。这说明秀丽隐杆线虫经URV后,有助于其体内的ROS产生。当活性氧自由基的数量超过体内抗氧化防御能力时,自由基代谢失衡,并引起细胞损伤[26-27]。同时根据老龄化的自由基理论,过度的ROS,特别是超氧化物阴离子及其衍生物,会加速其衰老的进程[28]。而AA可以降低UVR后秀丽隐杆线虫细胞内的ROS水平,减缓衰老速度,延长其寿命,从而对UVR损伤的秀丽隐杆线虫起到修复作用。

图5 AA对UVR后秀丽隐杆线虫体内荧光强度的影响Fig.5 Effect of AA on fluorescence intensity of C. elegans after UVR注:a:0 μmol/L+0 MJ/cm2;b:0 μmol/L+7 MJ/cm2; c:50 μmol/L+7 MJ/cm2。

3 结论

UVR会缩短秀丽隐杆线虫的寿命,UVR剂量越大,寿命越短;AA能够提高UVR损伤秀丽隐杆线虫的寿命、运动和产卵能力,且能降低其体内ROS的水平,表明AA对UVR后的秀丽隐杆线虫具有一定的保护作用;且AA对秀丽隐杆线虫UVR损伤的保护作用并不是简单的浓度依赖型,当AA浓度为50 μmol/L时,这种保护作用最为明显,但AA对秀丽隐杆线虫紫外损伤修复的作用机理还有待于进一步深入研究。研究结果为AA在抗UVR药品或功能食品中的应用提供实验依据。同时在其今后研究中可以从秀丽隐杆线虫体内细胞信号通路方向及基因水平等方面入手,对AA抗紫外辐射机制进行更加深层次的研究。