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(浙江省农业科学院食品科学研究所,浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室,浙江杭州 310021)

雪菜,又名雪里蕻(Brassicajunceavar. crispifolia),属十字花科芸薹属,是芥菜的变种,也称为叶用芥菜[1],在我国南北各地均有种植,尤其在江浙一带广为栽培。雪菜经腌制后,香气四溢,滋味鲜美,是腌渍蔬菜中最受欢迎的产品之一。

我国的渍菜腌制是依靠传统的食盐高渗透压进行,含盐量高达13%～15%。当前我国对腌渍菜低盐化尚无统一的评判标准。例如,我国第一个低盐泡菜地方标准“四川泡菜”规定泡菜的食盐含量≤4%,而榨菜行业标准规定的低盐榨菜标准含盐量≤7%[2],低盐发酵辣椒食盐含量≤8%[3]。在渍菜腌制过程中,调节盐分含量可达到调节脂质氧化及风味形成的目的[4-5]。腌制时,由于食盐产生渗透、扩散和吸收等物理现象而造成了原辅料之间的成分置换,同时借助微生物的发酵作用所产生的一系列生化学变化形成了腌制蔬菜特定的风味[6-7]。评价腌制蔬菜品质的指标有色泽形态、香气、质地、滋味等,一般认为优质腌制雪菜具有特有的香气,色黄、味鲜、有脆性[8]。

在企业生产加工中,由于生产周期的需要,雪菜采用高盐保存,包括目前的低盐产品也是高盐坯料经脱盐加工而成的。高盐可以使雪菜得以较长时间的保存,但是高盐容易产生高化学需氧量的卤水排放,导致河水及农田受到严重污染[9-10]。另外,高盐雪菜在加工过程中需要脱盐脱水等环节而导致加工工艺耗工费时、成本增加、风味与营养物质大量流失等,且高盐在腌制时亚硝酸盐生成较慢,亚硝峰出现晚,峰值高[11]。因此腌制蔬菜的低盐化处理越来越受到人们的青睐。但若仅依靠低盐,其最直接的结果是降低了渗透压对有害微生物的抑制作用,使雪菜易受有害微生物的侵染,影响了雪菜发酵过程中微生物的群落结构[12],将直接或间接地影响雪菜的风味和品质。

因此,本研究为了降低雪菜腌制过程中的用盐量,改变传统渍菜腌制坯料长久不变的高盐保存模式,以CO2或N2厌氧条件下的低盐雪菜以及传统的高盐雪菜为研究对象,分析了厌氧环境下雪菜中挥发性风味物质,结果可为厌氧条件长效保存与发酵提供指导,为改善我国传统腌制蔬菜的工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雪菜(Brassicajunceavar. multiceps)、食盐(食用级) 市售;CO2、N2纯度99.995%,杭州今工特种气体有限公司。

固相微萃取器手柄、SPME装置、65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)萃取头 美国Supelco公司;Trace DSQ GC-MS型气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan质谱公司;透明EVOH包装材料(透氧率为1.2 g/m2/d) 江苏省昆山市华亿塑料有限公司;CYES-Ⅱ型氧、二氧化碳气体测定仪 上海精胜科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同盐量低盐雪菜腌制 以雪菜作为原料,在腌制池中进行腌制。采用传统腌制方法,即一层菜体一层盐,用盐总量分别为7%(低盐)、14%(高盐),压实雪菜,最上层用重石压实,保存3个月。

1.2.2 厌氧条件下低盐雪菜腌制 选用一端开口的EVOH薄膜袋套在腌制容器中,开口的下沿部位打孔后安装充排气开关,雪菜按照1.2.1的方法盐腌制。采用CO2或N2气体调节厌氧环境,先用真空泵抽出EVOH薄膜袋中的空气并充入CO2或N2气体,并反复若干次直至袋中的压力达到0.06 MPa,袋中CO2或N2气体浓度达95%～98%时止。采用二氧化碳气体测定仪进行监测,当气体浓度不足时,充入气体并达到浓度要求。

1.2.3 HS-SPME-GC/MS分析腌制雪菜中的挥发性组分 采用顶空固相微萃取法(headspace solid-phase micro-extraction,HS-SPME)。取腌制3个月的不同部位各2 g,混合于10 mL的萃取瓶中,插入经老化的萃取头(DVB/CAR/PDMS,50/30 μm),于60 ℃水浴条件顶空下萃取30 min后气相色谱-质谱联用仪(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)进样,解析时间为5 min。

色谱条件:石英毛细管柱,CP-Wax52CB(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:40 ℃ 保持2 min,以5 ℃/min升温至100 ℃,保持2 min;再以10 ℃/min上升到250 ℃,进样口温度:250 ℃;载气He,流速1 mL/min。

质谱条件:电离方式EI,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃,传输线温度250 ℃。扫描质量范围45～300 amu。

GC-MS试验数据由Xcalibur 软件处理,未知化合物经计算机检索同时与 NIST谱库和Wiley谱库相匹配,只有当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以确认。按峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.3 数据处理

雪菜中主要挥发性成分通过Excel 2013软件进行汇总处理后导入SPSS 18.0 软件进行数据处理,根据各挥发性化合物种类的相对含量,采用CANOCO 4.5统计软件进行PCA主成分分析,比较不同处理与雪菜挥发性物质的相关性。

2 结果与分析

2.1 厌氧环境下低盐雪菜挥发性成分的GC-MS鉴定

对厌氧环境下的4组雪菜进行SPME-GC-MS分析,得到其总离子色谱图,见图1。

图1 雪菜挥发性成分GC-MS总离子色谱图 Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of potherb mustard(Brassica juncea var.)注:A:低盐;B:高盐;C:低盐CO2厌氧;D:低盐N2厌氧。

不同挥发性化合物出峰时间见图1。由图1可以看出,不同雪菜挥发性成分出峰时间和离子强度差异较大,表明不同样品间挥发性化合物差异大。总离子流图中各峰经质谱扫描后所得的质谱图,按各峰的质谱裂片与文献核对,采用计算机进行质谱数据库检索以及人工谱图解析,经综合分析鉴定,不同雪菜中挥发性物质种类及相对含量检测结果见表1。

表1 雪菜中挥发性物质SPME-GC-MS分析结果Table 1 SPME-GC-MS analysis results of volatile compounds

续表

由表1可知,从采用高盐、低盐、低盐厌氧(CO2或N2)处理的4组雪菜中分别鉴定出46、40、46和44种挥发性化合物,峰面积之和分别占总离子流色谱峰面积的91.12%、79.29%和84.17%、88.09%。挥发性化合物包括酯类、醛类、醇类、酸类、烃类、酮类和其他杂环化合物,其共同构成了雪菜的整体风味。4组雪菜挥发性物质分类如图2。

图2 厌氧环境对雪菜挥发性风味种类含量的影响 Fig.2 Different classes of volatile compounds from (Brassica juncea var)based on Anaerobic Environment

2.2 厌氧环境对雪菜主要挥发性风味物质的影响

2.2.1 对酯类化学物的影响 由表1和图2可知,分别采用低盐、高盐、厌氧低盐(CO2或N2)处理的4组雪菜中,酯类物质分别被检出11、7、12和8个,相对含量分别为44.97%、40.45%、37.00%和21.8%。由此可见,采用低盐量保存的雪菜酯类物质相对含量最高,且采用低盐量和低盐量CO2厌氧保存的雪菜酯类物质个数最多,而采用低盐N2厌氧保存的雪菜酯类物质相对含量最低,比低盐组减少了23.17%,低盐组与高盐组两者相差仅为4.52%。采用高盐、低盐和低盐CO2厌氧3组处理的雪菜中异硫氰酸酯类化合物均检出3个,相对含量最高,分别为32.72%、32.97%、16.02%,分别占雪菜中酯类物质的72.75%、81.50%和43.29%,为腌制雪菜的最主要挥发性物质。

雪菜茎叶中存在次生代谢产物GS,根据其侧链R基团来源不同可以将GS分为脂肪族、芳香族和吲哚族3大类[13]。不同种类的GS在硫苷酶作用下产生异硫氰酸酯类(isothiocyanates,ITCs)、腈类(nitriles)、硫氰酸酯类(thiocyanates,TCs)、环腈类、恶唑烷酮类化合物等,GS也能在微生物的作用下有效降解[14]。GS与硫苷酶反应需在有水存在的情况下进行,其酶降解是复杂的多途径降解反应过程。雪菜腌制过程中,环境因子和条件(pH、温度、时间)等因素共同决定了GS降解后产物的类型,依据主要降解产物可将其降解过程主要分为异硫氰酸酯、腈类与硫氰酸酯途径等3个方面(见图3)。异硫氰酸酯类(ITCs)为雪菜腌制过程中GS的主要酶解产物,雪菜在腌制的初期或早期,由于产生偏中性条件(pH5-8),硫苷酶水解GS生成的糖苷配基发生洛森重排反应后形成ITCs,同时ITCs的生成受GS上R基团影响,水解产生相应的具有挥发性的ITCs[15]。从GS的降解途径中可以解析为什么在雪菜挥发性物质中检测出吲哚以及部分腈类物质。

图3 硫苷酶解的主要降解产物[13]Fig.3 Main products of glucosinolates enzymatic degradation

近年来,越来越多的研究认为部分特定微生物也参与了GS的降解,如乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等[16]。早在20多年前,有学者就分离出了3种能降解GS的乳酸菌,并发现保加利亚乳酸杆菌能将GS分解成乳酸和异硫氰酸烯丙酯[17]。进一步研究发现植物乳杆菌和乳酸乳球菌等乳酸菌能分解30%～33%的GS,并生成腈类物质[16],表明乳酸菌在GS降解过程中发挥着重要作用。采用低盐N2厌氧保存的雪菜酯类物质相对含量低而腈类物质相对较高,可能是GS在N2的环境中其降解途径是偏向于腈类;另一方面,由于无氧环境抑制了好氧微生物的生长而有利于乳酸菌的生长,渍液pH较低盐量组和高盐量组低,也有利于向GS腈类物质途径降解(图3)。

2.2.2 醛醇类化合物 醛醇类化合物一般是酯质的降解产物,都具有香气。由表1和图2可知,分别采用低盐、高盐和低盐厌氧处理(CO2或N2)的4组雪菜中,醛醇类化合物分别被检出12、9、10和10个,相对含量分别为19.2%、17.32%、18.44%和33.22%,采用低盐N2厌氧处理的雪菜中醛醇类化合物较其他组均高。在检出的醛醇类化合物中,苯甲醛、苯乙醇的在4组雪菜中含量均为最高,而苯甲醛等具有玫瑰花香、蜂蜜香,可能来源于雪菜乳酸菌对氨基酸的代谢[18]。

2.2.3 酸类化合物 发酵蔬菜中酸类物质是乳酸菌发酵的主导产物[19-20],也是构成发酵蔬菜特殊香味主体的物质。4组雪菜中,低盐、高盐、低盐厌氧组(CO2或N2)酸类物质分别被检出7、6、9和8个,相对含量分别为7.62%、7.44%、15.88%和10.24%。十一烯酸、棕榈酸、十三烷酸在4组雪菜中均检出,肉豆蔻酸和2-丁烯二酸则均从两组厌氧环境雪菜中检出,且含量相对也较高,这可能和厌氧所形成的环境有关。

2.2.4 甲基硫化物类化合物 甲基含硫类化合物为腌制类蔬菜的特征类化合物,特别是以萝卜和芥菜类为原料的腌制蔬菜制品。在腌制过程中,一些芥子苷被芥子苷酶分解成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等硫醚化合物[21-22]。试验中检测出2种含硫类化合物,即在腌制萝卜中最常见的二甲基二硫和二甲基三硫,但是4组雪菜中其相对含量差异较大,分别为8.02%、0.7%、1.84%和0.83%。采用低盐保存组,含硫类化合物相对含量最高,其他组相对较低,高盐环境或者无氧环境抑制了微生物的繁殖及细胞破坏作用,减缓芥子苷的降解过程,从而使芥子苷降解产物在种类及相对含量上均比低盐腌制产品少。

2.2.5 烷、烃及其杂环类化合物 烷烃及其杂环类化合物在4组雪菜挥发性物质中相对含量分别为9.95%、12.2%、8.77%和12.94%,其中烯烃类化合物检出较低,杂环类物质主要为吡嗪、呋喃和萘等物质,其具有坚果香等温和的香味,杂环化合物的存在对泡菜整体风味的形成具有协同作用[23]。

2.3 雪菜挥发性化合物种类差异性分析

以4组雪菜和10类挥发性成分的相对含量为数据源进行差异性分析,结果见图4。图中箭头所处的象限表示影响因素与排序轴之间的正负相关性,箭头连线的长度代表着某个因子与研究对象分布相关程度的大小,连线越长,代表这个因子对研究对象的分布影响越大,箭头连线与排序轴的夹角代表这某个因子与排序轴的相关性大小,夹角越小,相关性越高[24],即当为锐角时表示两者之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。图4中的PC1(82.3%)和PC2(12.5%)累计方差贡献为94.8%,能够反映样本的大部分信息,因此选取前两个主成分(PC1-PC2)进行分析。由图4可知,不同处理方式保存的雪菜样本分别聚集在PCA得分图的不同区域。采用低盐组和高盐组保存的雪菜样本位于图的左下象限,而且距离间隔较小,表明这2个样本的相似性最大;低盐CO2厌氧保存雪菜样本位于图的左上方,但与低盐组和高盐组样本位于坐标轴同侧,反映了这3个样本之间有一定的相似性;低盐N2厌氧保存雪菜样本位于图的右下象限,与其他3个样本距离较远,说明与其他3个样本的相似性较小。图4也反应了不同处理样本与其挥发性化合物间的相关性。从图中可以看出,雪菜挥发性物质中,脂类、醇类、酸类和醛类与不同盐量与保存方式相关。

图4 不同处理雪菜挥发性化合物种类主成分分析Fig.4 Difference of volatile components in potherb mustard(Brassica juncea var)of different raw materials

3 结论

本实验运用顶空固相微萃取-气质联用(SPME-GC-MS)对高盐、低盐、低盐厌氧(CO2或N2)4组不同处理的雪菜中挥发性化合物进行了研究。在4组雪菜中共检测出46、40和46、44种挥发性化合物,主要包括酯类、醛醇类、酸类、烷烃及其杂环类物质,其共同构成了雪菜的整体风味。异硫氰酸酯类化合物为低盐、高盐和低盐CO2厌氧处理雪菜中最主要挥发性物质。雪菜挥发性化合物种类差异性分析表明,脂类、醇类、酸类和醛类化合物与不同盐量、保存方式相关。