石 楠，张莹莹，陈海清，李志辉，刘 双，于 凡，郭 璇，檀建新*

（1.河北农业大学 食品科技学院 河北省农产品加工工程技术研究中心，河北 保定 071001；2.河北大学 生命科学学院 河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071002；3.承德市农林科学院，河北 承德 067000；4.河北农业大学渤海校区 后勤管理办公室，河北 沧州 061100）

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）是一种食品行业中应用广泛的添加剂，微生物来源的TG通常被称为微生物谷氨酰胺转胺酶（microbial transglutaminase，MTG），被誉为“21世纪超级粘合剂”[1]，可应用于多种食品的加工过程中，例如肉类产品的重构、防止奶酪脱水收缩[2-4]、参与功能油脂的微胶囊化[5]等。MTG可以由多种微生物产生，如茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）[6]、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）[7]、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）[8]等。

对MTG产生菌进行筛选和检测时，通常采用经典的氧肟酸比色法[9]，但是该方法中底物N-羧基苯甲酰基L-谷氨酰基甘氨酸（N-α-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine，N-CBZ-Gln-Gly）价格昂贵且用量较大，不适于菌株的大规模、高通量检测筛选；因此，在菌种的初筛阶段，人们通常会采用比较廉价的蛋白质交联-絮凝沉淀法[10-11]或称凝胶法[12]，然而微生物的发酵液通常组成复杂，代谢产物中有很多成分可以使酪蛋白凝集或沉淀，很容易对凝胶现象的观察造成干扰；BOURNEOWC等[13]曾建立了一种滤纸片（filter paper disc，FPD）检测法，但这种方法获得的阳性菌落需要事先复印在其他非显色平板上，显色后再对应菌落位置选择接种，不利于后续复筛。

Image J是一种广泛应用于各种科学图像分析处理的开放软件[14]，如医学影像分析[15-16]、真菌孢子观察[17]等。因此，本研究将一株MTG产生菌拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5经紫外诱变后产生的突变株接种于含有固体培养基的96孔板中，在孔内进行酶活检测反应，采用Image J软件获取各孔显色结果的灰度均值，根据该值大小进行突变株的初筛，以期建立MTG产生菌的半定量-高通量筛选方法，为MTG高产菌株或新产生菌的快速半定量-高通量筛选提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5：分离自河北省承德地区土壤样本，分离纯化后高氏斜面4℃保存。

1.1.2 试剂

N-CBZ-Gln-Gly、盐酸羟胺、还原型谷胱甘肽、L-谷氨酸-γ-单羟肟酸：美国Sigma公司；谷氨酰胺转氨酶-B（transglutaminase-B，TG-B）酶粉（酶活10 U/g）：上海雪丰国际贸易有限公司；其余常规生化试剂：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3 培养基

高氏培养基：可溶性淀粉20 g/L、KNO31 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、琼脂粉12 g/L、蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4。

营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：牛肉膏1 g/L、酵母粉2 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂粉12 g/L、蒸馏水1 L，pH 7.4。

种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蒸馏

水1 L，pH 7.0。

发酵培养基：葡萄糖25g/L、蛋白胨35g/L、酵母粉2g/L、NaCl 5 g/L、蒸馏水1 L，pH 7.2。

孢子萌发培养基：可溶性淀粉1 g/L、（NH4）2SO42 g/L、KH2PO41g/L、NaCl 1g/L、MgSO4·7H2O1g/L、微量元素溶液（FeSO4·7H2O 1 g/L、MnCl2·4H2O 1 g/L、ZnSO4·7H2O 1 g/L）1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0。

以上培养基中，种子培养基与发酵培养基灭菌条件为115℃，20 min；其余培养基灭菌条件均为121℃，15 min。

1.2 仪器与设备

Costar96孔板：美国Corning公司；软件ImageJ2x（2.1.4.7）：美国国家卫生研究院；756P紫外-可见分光光度仪：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 突变株的获得

取新鲜培养孢子成熟的菌株109.5高氏斜面，用孢子萌发培养基将斜面上的孢子洗下，无菌擦镜纸过滤去除菌丝，置于含有50 mL孢子萌发培养基和适量玻璃珠的250 mL三角瓶中，调节孢子悬液浓度约为1×108CFU/mL，温度30℃、转速200 r/min条件下摇床振荡2～3 h，使孢子萌发至菌丝长度约为孢子直径的一半。将孢子悬液置于无菌平皿中进行紫外（ultra violet，UV）诱变，UV诱变条件：紫外灯20 W，照射距离25 cm，照射时间60 s。诱变后的孢子悬液经梯度稀释（稀释梯度10-3、10-4、10-5），将稀释液涂布于高氏培养基平板，30℃避光倒置培养3 d，至单菌落长出。挑取生长迅速、菌落边缘整齐、孢子丰富的单菌落转接至高氏斜面，每个单菌落转接1支高氏斜面。

1.3.2 96孔板反应体系的确定

酶活测定底物液：0.2 mol/L Tris-乙酸缓冲液（pH 6.0）中N-CBZ-Gln-Gly 30 mmol/L、盐酸羟胺0.1 mol/L、还原型谷胱甘肽10 mmol/L。

酶活测定终止液：三氯乙酸-氯化铁溶液，由5%FeCl3、12%CCl3COOH、3 mol/L HCl等体积混和。

选择谷氨酰胺转氨酶的商品酶制剂TG-B酶粉作为确立反应体系的标准参照物，以确定96孔板中酶显色反应的适宜条件。配制TG-B酶粉酶活梯度溶液（0、0.01 U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.6U/mL、0.8U/mL），酶活测定参考氧肟酸比色法[9，12]并有所改进；考虑到接种到固体培养基上的突变株分泌的酶量未知但有限，故取10μL酶液（即酶量范围为0.000 1～0.008 0 U）加入无菌96孔板的孔中，分别加入底物液10μL和30μL，37℃培养箱温浴10 min后加等体积终止液显色，根据颜色深浅确定适宜反应体系。

1.3.3 96孔板培养基的选择

分别取高氏培养基、发酵固体培养基和营养琼脂培养基于无菌96孔板中，每孔200μL；采用接种环从斜面菌种上刮取相同面积（0.3 cm×1.0 cm）的部分突变株和出发菌株分别接种至3种培养基，涂布涂匀；96孔板加盖并用封口膜密封，置于30℃条件下培养3 d。取底物液加入培养好的菌体表面，37℃培养箱温浴10 min，加终止液显色，对比几种培养基的显色效果，确定最适培养基。

1.3.4 谷氨酰胺转氨酶突变株的半定量-高通量筛选

制备含有适宜培养基的96孔板，将突变株自高氏斜面接种至培养基，保持接种量基本一致，且涂布均匀，每个菌株接种一个孔；同时接种出发菌株109.5作为对照（CK），30℃条件下培养3 d。

在软件Image J中打开显色结果图片，转换图片类型为32-bit（32位）灰度图像，从分析菜单栏的工具选项中调出目标区域（region of interests，ROI）工具，用椭圆取图选中待分析的孔，调整取图框边界以适应孔内待测区域，加入到ROI工具中；重复以上操作至选择完毕所有需要分析的孔，点击ROI工具中的测量选项获得计算结果。结果数值中以灰度平均值体现不同孔的颜色深浅差异。灰度值指黑白图像中点的颜色深度，范围在0～255之间，白色为255，黑色为0；故颜色越深则数值越小。

1.3.5 突变株的复筛

将筛选得到的正突变株从高氏斜面接种至装有10 mL种子培养基的100mL三角瓶中，每株接种3瓶，30℃、200r/min条件下培养30h后按3%（V/V）接种量分别转接至装有60mL发酵培养基的300 mL三角瓶中，30℃、200 r/min条件下培养70 h后，9 000 r/min离心3 min，取上清液即为粗酶液，测定MTG活力。

参考经典氧肟酸比色法[9，12]测定MTG活力：取200μL粗酶液置于1.5mL离心管中，加入200μL底物液，37℃培养箱温浴10min后加200μL终止液显色，反应体系经12000r/min离心1 min，采用分光光度仪测定上清液在波长525 nm条件下的吸光度值，根据L-谷氨酸-γ-单羟肟酸生成的标准曲线（y=0.191 1x+0.017 1，R2=0.998 1）计算MTG酶活力；MTG酶活力单位：37℃条件下每分钟催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸所需要的酶量[8，18]。

2 结果与分析

2.1 拟无枝酸菌109.5的紫外诱变

菌株109.5是从土壤样品中分离到的野生型菌株。有文献报道[19]，对于野生型菌株，诱变初始采用较高的剂量，容易引起遗传物质发生较大幅度的变异，如此获得的突变株不易回复突变，遗传特性比较稳定。菌株109.5经紫外诱变60 s后，致死率达到99.75%，属于较高剂量范围；最终共获得突变株334株，编号为1～334。

2.2 96孔板反应体系的确定

两种反应体系的显色结果见图1。

图1 两种反应体系的显色结果Fig.1 Color results of two kinds of reaction systems

由图1可知，L1反应体系中整体颜色偏浅，无法指示酶浓度的变化；而L2反应体系中随着酶浓度的增加，反应体系颜色逐渐加深。说明在给定酶量的酶粉溶液中，L1反应体系中的反应物不足量，不足以完全指示酶活力大小；L2体系中的反应物足量，检出限可达0.000 1 U酶量，可以通过显色结果推断酶的浓度。由此确定96孔板固体培养基筛选的反应体系为底物液和终止液各30μL。

2.3 96孔板筛选培养基的确定

随机选取6株突变菌株（1编号为1～16），与出发菌株109.5（CK）同时接种在96孔板中的3种培养基上。培养3 d后，3种培养基中菌体均正常生长。加入30μL底物液和终止液显色后结果如图2所示。

图2 96孔板中突变菌株在3种固体培养基上的显色结果对比Fig.2 Color result comparison of mutants on three kinds of solid media in 96-well plates

由图2可知，高氏培养基上生长的菌株未产生明显的颜色反应，说明高氏培养基仅可供菌体生长而不利于菌种产MTG；发酵固体培养基与营养琼脂培养基上的菌株有明显的颜色反应，说明这两种培养基适合菌株产MTG。

图3 突变株在两种固体培养基上的生长情况与显色结果Fig.3 Growth situations and color results of mutants on two kinds of solid media

随机选取38株突变株（编号为1～38）与出发菌株109.5（CK）分别接种到含有发酵固体培养基与营养琼脂培养基的96孔板中，每孔含培养基200μL，30℃培养3d后进行显色反应。同时取酶活分别为0、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1 U/mL的TG-B酶粉溶液10μL加入空白未接种孔（内含相同培养基），其它生长菌落孔中加10μL Tris-乙酸溶液，以使每孔内的溶液终体积一致，一同进行显色反应；以观察低酶活的酶粉溶液在固体培养基上的显色效果。结果见图3。

由图3可知，低酶活酶粉溶液在两种培养基上均可以呈现肉眼可见的颜色变化，突变株也呈现了明显的颜色差异；但相对而言，发酵固体培养基的本底颜色较深，有的突变株在生长过程中就使培养基出现了颜色变化；而营养琼脂培养基被认为是对检测时颜色干扰较少的培养基[13]，本底浅，能突出显色反应后的颜色差异。因此营养琼脂培养基适宜作为突变株筛选的培养基。

2.4 产谷氨酰胺转氨酶突变株的半定量-高通量筛选

将其余296株突变株及出发菌株109.5（CK）分别接种于含有营养琼脂培养基的96孔板中，30℃条件下培养3 d后进行显色反应。在Image J软件中打开所要分析的显色结果图片，依次选取每个孔的显色区域，测定所有突变株的灰度均值，部分灰度均值见表1。

表1 部分突变株的灰度均值Table 1 Grayscale averages of some mutants

以CK菌株的灰度均值85.883为参比，低于此值的即为正突变株。由表1可知，38株突变株中，正变株有24株，其中均值最小的是突变株19，灰度均值为54.684。按照这种方法，从334株突变株中初筛获得6株灰度均值明显减小的正突变株（P＜0.01），菌株编号分别为19、80、118、127、227、229。

2.5 筛选结果验证

将初筛获得的6株正突变株进行摇瓶发酵复筛，同时随机选取一株灰度均值＞CK菌株的突变株212（即负突变株）同时进行摇瓶发酵作为对照。MTG酶活测定结果见表2。

表2 突变株的MTG活力测定结果Table 2 Determination results of MTG activity of mutants

由表2可知，6株正突变株的MTG活力确实＞CK菌株；而负突变株212的MTG活力＜CK菌株。其中突变株80的MTG活力最高，为0.803 U/mL，比出发菌株（0.323 U/mL）MTG活力提高148.6%，而负突变株212的MTG活力为0.241U/mL，下降25.3%。

由此可见，基于Image J的96孔板固体培养适用于产MTG拟无枝酸菌株109.5突变株的初筛，并实现突变株的半定量-高通量筛选。相比于摇瓶发酵，96孔板固体培养筛选简化为一步接种在固体培养基上显色对比灰度均值，节省了时间和培养基的用量，也节省了培养空间。另外，96孔板内每个孔的培养基体积都相等，在接种量保持基本一致的前提下，显色结果可以体现突变株的产酶差异，且相比于肉眼直接观察的无法定量的凝胶法筛选，可以通过灰度均值来实现半定量测定及产酶能力-高通量筛选。

3 结论

采用96孔板固体培养结合Image J图像处理软件获取菌落显色反应的灰度均值，实现了产MTG拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5紫外诱变突变株的半定量测定及产MTG酶能力的高通量筛选。通过该方法从拟无枝酸菌株109.5紫外诱变后获得的334株突变株中成功筛选到一株MTG高活力突变株80，较出发菌株109.5的MTG活力提高148.6%。相对于传统的摇瓶发酵筛选，这种半定量-高通量筛选方法大大节省了培养空间和程序，可以推广应用至其它也需通过显色反应进行筛选的菌株；可作为MTG突变菌株的高通量筛选方法，为进一步扩大MTG产生菌资源从而开发更好的食品用酶制剂提供技术支持。