吴双双，刘文龙，邓雪菲，石 鹤，冯艳丽*

（1.湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002；2.湖北师范大学 生物学国家级实验教学示范中心，湖北 黄石 435002；3.湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435002）

红曲菌又叫红曲霉，是一种小型丝状真菌，营腐生，属真菌门（Eumycophyta），子囊菌纲（Ascomycetes），真子囊菌亚纲（Euascomycetes），散囊菌目（Eurotiales），红曲菌科（Monascaceae）红曲霉属（Monascus）[1-2]。红曲菌的种类有20多种，主要有紫色红曲菌（Monascuspurpureus）、红色红曲菌（Monascus ruber）、丛毛红曲菌（Monascus pilosus）等[3]。红曲菌是我国重要的药食同源微生物，其发酵产物红曲最早发现于中国，已有近两千年的生产、应用历史。红曲是由红曲菌接种于大米经发酵而来，在古代既是一种食品，又可做药用[4-5]。据研究发现，红曲菌在发酵过程中可产生多种次级代谢产物，其中主要的代谢产物有红曲色素（Monascus pigments，MPs）、莫纳可林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸、麦角固醇等，部分红曲菌还可产生真菌毒素——桔霉素[6-7]。上述代谢产物中，研究和应用较为广泛的为MPs和MK。

MPs具有热稳定性好，蛋白着色力强，对pH稳定，安全无毒等特点，在食品工业中被用作天然食品着色剂[6-7]。MK是1979年日本学者远藤章从红色红曲菌（Monascusruber）的发酵物中分离出来的活性物质，研究发现，在胆固醇生物合成途径中，羟甲基戊二酰单酰辅酶A（HMG-CoA）的还原酶是控制胆固醇合成的关键酶，而MK是这种酶的竞争性抑制剂，可以有效的减少或阻断内源性胆固醇的合成，调节人体的血脂血压[8-10]。桔霉素是红曲菌目前所发现的唯一一种真菌毒素，对肾脏有毒害作用，还可能诱发肿瘤，致畸，致突变等[11-13]，但并不是所有的红曲菌都会产生桔霉素。

然而，桔霉素对红曲类产品的污染严重影响了该产业的健康发展。筛选高产MPs及MK且不产或低产桔霉素的红曲菌显得尤为重要，而紫外诱变及化学诱变因操作简便、效果好等原因得到广泛应用[14-15]。本研究以MS-1为出发菌株，采用紫外诱变、LiCl诱变及复合诱变的方法，筛选高产MPs和MK且遗传稳定的红曲菌株。该研究结果对安全、高效的红曲菌株筛选及应用具有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

丛毛红曲菌（Monascuspilosus）MS-1（CCTCCM 2013295）：由红曲产品中分离所得。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200g切块，加入1300mL的蒸馏水煮20 min，待土豆熟软后经4层尼龙布过滤，取滤液定容至1 L，加入20 g葡萄糖及20 g琼脂粉搅拌溶解，分装后于121℃灭菌20 min待用。

洛伐他汀抗性培养基：在PDA培养基中加入一定量的洛伐他汀（lovastatin），使培养基中洛伐他汀的质量浓度分别为1.1 mg/mL、1.3 mg/mL、1.5 mg/mL、1.7 mg/mL、1.9 mg/mL和2.1 mg/mL，灭菌待用。

种子培养基：在干净的空三角瓶中加入葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，以土豆汁代替蒸馏水溶解上述药品，定容后分装灭菌，制成种子培养基待用。

固态培养基：优化后的培养基米粉和豆粉比例为3∶2[17]，原始培养基为纯米粉。将培养基加入250 mL三角瓶中，用蒸馏水溶解一定量的乙酸和MgSO4·7H2O，平均分装后搅拌混匀，灭菌冷却后再加入12.5 mL无菌水，使培养基初始含水量、乙酸含量及MgSO4·7H2O浓度分别为35%，6 g/L和0.004 mol/kg。

1.1.3 试剂

葡萄糖粉剂：重庆和平制药有限公司；七水硫酸镁、无水氯化钙、无水氯化锂、磷酸二氢铵、冰乙酸、蛋白胨、琼脂粉、无水乙醇（均为分析纯或生化试剂）、乙腈（色谱纯）、磷酸（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。MK标准品（纯度≥98%）：阿拉丁公司；怡宝纯净水：市售。

1.2 仪器与设备

BCM-1300A生物洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；CP114电子天平：奥豪斯仪器有限公司；BSA2202S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；UV-5100 B紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Agilent 1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：安捷伦科技有限公司；LRH-80生化培养箱、DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：武汉一恒苏净科学仪器有限公司；HZQ-F160振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子悬液的制备

将红曲菌MS-1接种于装有PDA培养基的茄子瓶中，在30℃条件下静置培养10 d。取15 mL无菌水洗脱上述茄子瓶中的红曲菌孢子，倒入装有玻璃珠的无菌锥形瓶内，充分振荡后经3层无菌擦镜纸过滤，制成均一的孢子悬液。根据需要将孢子悬液稀释至105～106CFU/mL。

1.3.2 种子液培养及固态发酵

茄子瓶培养的红曲菌，用15 mL无菌水洗脱菌丝，倒入带有玻璃珠的无菌锥形瓶内振荡打散，吸取菌液加入种子培养基中，在130 r/min、30℃条件下培养36 h。固态发酵时，种子液接种量为130g/L，在30℃条件下培养2～3d，待培养基变红后调节培养箱温度为25℃，培养至14 d。将培养好的红曲米于55℃条件下烘干12 h后粉碎，制得红曲粉末。

1.3.3 红曲发酵产物中色价的测定

采用紫外分光光度法测定红曲产品的色价。取50mL离心管，加入0.3 g红曲粉和10 mL体积分数75%乙醇，充分振荡后超声提取1 h，静置15 min，分别取上层清液3 mL和4 mL于离心管，8 000 r/min离心10 min，放冰箱冷藏待用。取3 mL提取液，用体积分数75%的乙醇稀释适当倍数，以体积分数75%乙醇在波长505 nm处的吸光度值（OD值）为0作为对照组，调整紫外分光光度计，测定红曲粉末中色素的吸光度。红曲色素的色价计算公式如下：

1.3.4 红曲发酵产物中MK的测定

采用已优化的高效液相色谱法检测红曲产品中MK[17-18]。取保存的4 mL提取液，用体积分数为75%乙醇稀释至适当倍数，经孔径0.22μm的有机滤膜过滤，用HPLC法测定MK含量。HPLC系统为Agilent1260，色谱柱为Inertsil ODS-3，流动相为乙腈∶水∶0.5%磷酸=60∶37∶3（V/V），流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长238 nm，进样量20μL。红曲样品中MK含量的计算公式如下：

1.3.5 紫外条件下诱变红曲菌

取5mL孢子悬液于无菌培养皿中，置于15 W紫外灯下15 cm处[19]，照射30 s。按10倍梯度稀释法将经UV处理过的孢子悬液依次稀释至10-3～10-7浓度，立即浸入冰水中暗室保存15 min备用。

取稀释至10-3～10-7冰浴后的诱变悬液0.5 mL于平板中，倒入冷却至室温的PDA培养基，摇匀冷却，凝固后制成计数平板，倒置于30℃条件下培养4～5 d，每一浓度取三个平行。记录平板菌落数，计算诱变致死率。

取稀释到10-3～10-7冰浴后的诱变孢子悬液0.2 mL于平板中，倒入Lovastatin抗性培养基，摇匀冷却制成Lovastatin抗性平板，每组3个平行，于30℃条件下避光培养4～5 d。挑取菌落生长速度较快的诱变菌落于试管培养7 d后转至茄子瓶扩培10 d。

在以上条件下，调节照射时间分别为60 s、90 s，进行紫外诱变，计算致死率。

1.3.6 红曲菌的化学诱变

取稀释到10-3～10-7浓度的MS-1原始孢子悬液0.2 mL于平板中，摇匀，倒入含有0.8‰LiCl的Lovastatin抗性培养基，制成含LiCl的Lovastatin抗性平板，每组三个平行，于30℃条件下避光培养4～5 d，挑取菌落生长速度较快的诱变菌落于试管培养7 d后转至茄子瓶扩培10 d。

1.3.7 红曲菌的复合诱变

取稀释到10-3～10-7冰浴后的诱变孢子悬液0.2 mL于平板中，摇匀，倒入含有0.8‰LiCl的Lovastatin抗性培养基，制成含LiCl的Lovastatin抗性平板，每组三个平行，于30℃条件下避光培养4～5 d。挑选菌落生长速度较快的诱变菌落于试管培养7 d后转至茄子瓶扩培10 d。

1.3.8 诱变红曲菌的复筛

将上述三个初筛实验中保留的16株诱变菌种继续做优化后培养基固态发酵，发酵方法同1.3.2，14 d后检测其产MPs和MK含量，与初筛时固态发酵相比较，复筛出产MPs或MK较高的诱变菌。

1.3.9 高产MK诱变菌株的遗传稳定性实验及高产MPs诱变菌株的验证

将复筛得到的高产MK的诱变菌株接种于茄子瓶斜面培养基上，30℃培养10 d，按照1.3.2的方法进行重复性固态发酵实验，连续传代5次，测定红曲米中MK的含量，测定方法同1.3.4。此外在固态发酵过程中，发现两株诱变菌在优化后高产MK的配方（米粉∶豆粉=3∶2），培养方式为30℃条件下发酵3 d变温至25℃培养至14 d固态发酵，产生大量MPs。为验证这一现象，将这两株菌ZWS1和ZWS5与MS-1以纯大米为基质进行固态发酵，在30℃恒温培养14d。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变的结果分析

2.1.1 15 cm 30 s紫外条件下诱变对红曲菌产MPs和MK的影响

研究发现，在低浓度的Lovastatin抗性平板下培养均长出大量诱变菌落，而在2.1 mg/mL条件下菌落相对较少，经15 cm 30 s紫外诱变和2.1 mg/mL Lovastatin抗性平板下培养选育后，选出7株诱变菌，于固态培养基发酵14 d，以出发菌株MS-1产MPs和MK为对照组，其实验结果如图1所示。

图1 15 cm 30 s紫外诱变条件下各菌株与对照菌株MS-1产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.1 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 30 s

由图1可知，在15 cm 30 s紫外诱变下，与出发菌株MS-1产MPs及MK含量相比，所有菌株均呈现正突变。其中菌株ZWT3、ZWT5、ZWT6的MPs和MK产量增加最为显著。MPs产量分别增加了290.41%、293.50%和291.34%，MK产量分别增加了178.51%、175.25%和161.45%，故保留诱变菌株ZWT3、ZWT5、ZWT6这3株菌做复筛实验。

2.1.2 15 cm 60 s紫外条件下诱变对红曲菌产MPs和MK的影响

为提高突变率，将诱变时间提至60 s，经质量浓度2.1mg/mLLovastatin抗性平板培养选育后，选择9株诱变菌在固态培养基上发酵14 d，以出发菌株MS-1为对照组，其产MPs和MK结果如图2所示。

如图2A所示，出发菌株经过15 cm 60 s紫外照射诱变后，诱变菌株ZWS1和ZWS5的MPs产量较出发菌株MS-1提高，分别提高了398.69%、400.07%，菌株ZWS2降低了61.1%，其他菌株无明显变化。如图2B所示，与出发菌株MS-1相比，诱变菌株ZWS1和ZWS5固态发酵后MK产量提高，分别提高了34.07%、21.65%，菌株ZWS2、ZWS4、ZWS9的MK产量降低了23.51%、38.71%、30.72%，为负突变。综合图2A、B，选择诱变菌株ZWS1、ZWS5这两株菌做下一步复筛实验。

图2 15 cm 60 s紫外诱变条件下各菌株与对照菌株MS-1产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.2 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 60 s

2.1.3 15 cm 90 s紫外条件下诱变对红曲菌产MPs和MK的影响

图3 15 cm 90 s紫外诱变条件下各菌株与对照菌株MS-1产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.3 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains and control strain MS-1 at ultraviolet mutagenic condition of 15 cm 90 s

为提高诱变效果，将诱变时间提至90 s，经质量浓度2.1 mg/mL Lovastatin抗性平板下培养选育后，选择3株诱变菌在固态培养基上发酵14d，以出发菌株MS-1为对照组，其MPs和MK产量结果如图3所示。

如图3A所示，经15 cm 90 s紫外照射诱变筛选出的诱变红曲菌与出发菌株MS-1相比，诱变菌株ZWN1、ZWN2产MPs能力分别提高了129.65%和74.87%。如图3B所示，ZWN1产MK能力提高了40.93%。结合图3A、图3B，保留菌株ZWN1和ZWN2做复筛实验。

2.2 氯化锂化学诱变对红曲菌产MPs和MK的影响

由于诱变的不定向性，为提高突变率，采用0.8‰氯化锂化学诱变对原始菌株MS-1进行处理，所得菌株通过固态发酵产MPs和MK情况如图4所示。

图4 LiCl化学诱变条件下各菌株与对照菌株MS-1产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.4 Comparison of Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B) of different strains at the condition of LiCl chemical mutagenesis

如图4A所示，与出发菌株MS-1相比，诱变菌株LHL1、LHL2产MPs能力分别提高了122.11%和94.72%，如图4B所示，菌株LHL1、LHL2产MK能力分别提高了71.21%和48.63%。结合图4A、图4B，保留菌株LHL1、LHL2做复筛实验。

2.3 紫外-氯化锂复合诱变对红曲菌产MPs和MK的影响

为提高突变的多样性，采用0.8‰氯化锂及15 cm 90 s紫外的复合诱变对原始菌株MS-1进行处理，所得菌株通过固态发酵产MPs和MK情况如图5所示。

如图5A所示，与出发菌株MS-1相比，诱变菌株FH3、FH5产MPs能力分别提高了76.76%和145.23%。如图5B所示，菌株FH2、FH5产MK能力分别提高了35.74%和38.95%。结合图5A、图5B，保留FH2、FH3、FH5这3株菌做复筛实验。

图5 复合诱变条件下各菌株与对照组MS-1产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.5 Comparison of Monascus pigment value(A)monacolin K content(B) of different strains at the condition of complex mutagenesis

2.4 诱变菌株的复筛

图6 初筛和复筛后各菌株产红曲色素色价（A）和莫纳可林K含量（B）的比较Fig.6 Comparison of the Monascus pigment value(A)and monacolin K contents(B)in different strains of screening and secondary screening

将上述五个初筛实验中保留的12株诱变菌种继续做固态发酵，方法同1.3.2，14 d后检测其MPs和MK产量，与初次获得诱变菌时MPs和MK产量进行对比，结果如图6所示。

由图6A可知，复筛后的诱变菌产MPs与初筛时相比，产量较高且较稳定的菌株有菌株ZWS1和ZWS5，由图6B可知，产MK含量较高且较稳定的菌株有菌株ZWN2、LHL1、FH2和FH3这4株菌。故保留这6株菌做遗传稳定性和验证实验。

2.5 高产MK诱变菌株的遗传稳定性实验及高产MPs诱变菌株的验证

将复筛得到的5株高产MK的诱变菌株接种于茄子瓶斜面培养基上，30℃培养10d，按照1.3.2的方法进行重复性固态发酵实验，连续传代5次，测定红曲米中MK的含量，结果如表1所示。结果表明，菌株LHL1、ZWN2和FH2这三株诱变菌株产MK的能力每一代都相差不大，遗传稳定性较好，而诱变菌株FH3产MK能力不稳定，因此选择菌株LHL1、ZWN2和FH2这三株高产MK的诱变菌继续做研究。

表1 诱变红曲菌的遗传稳定性Table 1 Genetic stability of mutant Monascus strains

在固态发酵过程中，使用的配方是优化后高产MK的配方（米粉∶豆粉=3∶2）变温培养，但发酵过程中发现，两株诱变菌ZWS1和ZWS5在高产MK固态培养基中产生大量MPs。为验证这一现象，考虑到添加豆粉主要是促进MK的产生[17]，在优化后配方中主要对MPs产生呈抑制作用。故将上述两株菌ZWS1和ZWS5与MS-1以纯大米为基质进行固态发酵，在30℃恒温培养14 d，检测其产MPs结果如图7所示。

图7 高产MPs诱变菌恒温条件下产红曲色素情况Fig.7 Production of MPs of mutagenic strains with high yield Monascus pigments at constant temperature condition

如图7所示，菌株ZWS1产MPs能力较出发菌株MS-1有所下降，与之前结论相悖。说明该菌株在不同培养基中产MPs的能力相差较大，可在后续研究中进一步确定其产MPs的能力及最适培养条件。ZWS5菌株与出发菌株MS-1相比，产MPs能力提高了23.36%，具有后续研究的意义。

3 结论

对高产MPs和MK，不产桔霉素的原始菌株MS-1进行一系列单因素诱变和复合诱变初筛以及固态发酵复筛和遗传稳定性实验，分别得到1株高产红曲MPs的诱变菌ZWS5和3株高产MK且遗传稳定性良好的诱变菌ZWN2、LHL1和FH2，其中菌株ZWS5产MPs总色价为1 476.25 U/g，与出发菌株MS-1相比产MPs能力提高了23.36%；菌株ZWN2、LHL1和FH2的MK产量分别为7.34 mg/g、7.03 mg/g、和7.16 mg/g，比原始菌株MS-1产MK能力（5.75 mg/g）（第五代遗传稳定性实验结果）分别提高了27.65%、22.26%和24.52%。