周明罗，陈 杰，游 玲，王 涛

（1.宜宾学院 资源与环境工程学院，四川 宜宾 644007；2.宜宾学院 发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644007）

微生物絮凝剂是一类具有絮凝活性的微生物代谢产物或分泌物，主要成分为蛋白质、糖蛋白、多糖及脱氧核糖核酸等物质，具有大量的氨基、肽键、羟基、芳环等多种活性官能团[1-3]，这些官能团的电性差异能使水中细小颗粒物及胶体态物质吸附、凝聚、沉淀，从而有效去除污水中的悬浮物（suspended solids，SS）及胶体物质。微生物絮凝剂对有机物、浊度、色度、金属离子等污染物的去除及污泥脱水均有良好效果[4-6]，具有高效、广谱絮凝、生物可降解、安全无毒、无二次污染等优点，长期以来受到国内外研究者的关注。目前，在絮凝机理、活性成分、絮凝活性微生物来源、应用条件等[7-10]方面都有大量研究。然而，微生物絮凝剂工业化发展缓慢，实际工程应用仍然较少，生产制备成本高是主要限制因素之一。其中，培养基成本约占微生物絮凝剂生产总成本70%[11-12]。因此，探求优良、廉价的培养基，是克服这一瓶颈的有效途径。

众多学者研究了以豆腐废水、啤酒废水、酿醋废水、屠宰废水等作为培养基对产絮凝菌进行培养[13-15]，而以白酒酿造废水作为廉价培养基还鲜有报道。白酒酿造大多以小麦、高粱、玉米等为原辅料，其生产废水主要包括黄水、底锅水等，含有大量蛋白质、糖类、淀粉等含碳、氮有机物[16]，这些含碳、氮物质是微生物生长必需的营养物。本研究从活性污泥中分离产絮菌，以白酒酿造废水为廉价培养基，可有效降低白酒废水中的有机物污染物浓度，实现以废治废，同时将白酒废水中含碳、含氮有机物资源化利用以降低微生物絮凝剂的培养成本，为微生物絮凝剂选取廉价培养基提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与废水

菌种从宜宾市城市污水处理厂周期循环活性污泥法（cyclic activated sludgesystem，CASS）生化池的活性污泥中筛选、分离获得。

白酒酿造废水取自宜宾某酒业公司酿造车间黄水及底锅废水，主要污染物浓度为总氮（total nitrogen，TN）210.5 mg/L、总磷（total phosphorus，TP）25.6 mg/L、化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）20.8 g/L、五日生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD5）10.2 g/L。

1.1.2 试剂及培养基

主要试剂：培养基原料（化学纯）、高岭土、NaOH（分析纯）、盐酸（工业级）等；

富集、分离培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，琼脂12 g（富集培养基中不添加），NaCl 4.0 g，pH=7.0～7.2，加水至1 L，121℃灭菌20 min；

发酵培养基：葡萄糖15g、MgSO40.3g、（NH4）2SO40.3g、酵母膏0.75 g、尿素0.75 g、KH2PO43 g、K2HPO47.5 g、pH 7.1，加水至1 L，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

78HW-1恒温培养箱、BSD-YXF2200恒温摇床：上海博讯实业有限公司；SANYO高压灭菌锅：SANYO公司；DM 2000光学显微镜：德国莱卡公司；Lynx6000离心机：美国thermo公司；PHS-3CpH计：上海雷磁仪器厂；无菌操作台、TU-1901紫外可见光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；EppendorfAG分子扩增PCR仪：德国Eppendorf公司；Malvern Mastersizer 3000E粒径分析仪：英国Malvern公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种分离与鉴定

菌株分离：取CASS反应池的混合液2mL，加入98mL富集培养基中，在35.8℃、摇床转速120 r/min条件下，培养时间24 h后，取发酵培养液用无菌水稀释1 000倍后，取1 mL接种于分离培养基上，32℃恒温培养36 h，观察菌落形态，挑取单菌落，继续在分离培养基平板划线纯化3次，得到纯培养菌株，转接到分离培养基斜面上，4℃保存备用。

絮凝菌株筛选：将分离纯化获得的菌株，接种到发酵培养基，120 r/min、32℃振荡培养72 h获得发酵液，根据发酵液对高岭土悬浊液的絮凝效果，选出高效的絮凝剂产生菌。

菌株鉴定：根据文献[17]提供的方法，适当修改。提取培养物基因组DNA后，聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）扩增16SrDNA。细菌引物[18]27f：5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3'和1541r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，PCR反应体系和反应条件参照文献[17]的方法进行，菌株16Sr DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成，将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，通过Blast与模式菌株比对，将其鉴定到种。

1.3.2 微生物絮凝剂的制备

将优选获得的菌株，在设定条件下培养，获得的发酵培养液即为微生物絮凝剂，采用单因素法，考察白酒废水COD、培养时间、初始pH、外加氮源、磷源等因素对絮凝效果的影响，并优化白酒酿造废水制备微生物絮凝剂的培养条件。

1.3.3 絮凝效果的测定

向100 mL 4 g/L的高岭土悬浊液中加入5 mL微生物絮凝剂（发酵培养液），于200 mL烧杯中快速搅拌1 min，慢速搅拌3 min，静置20 min，取上清液用紫外可见分光光度计在波长550 nm处测吸光度值，每次3个平行样，并按式（1）计算絮凝率（η）。

式中：Ao为原悬浊液吸光度值；A为絮凝后悬浊液吸光度值。

1.3.4 水质及絮体粒径测定方法

COD的测定采用HJ/T 399—2007《水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法》；BOD5的测定采用HJ 505—2009《水质五日生化需氧量的测定稀释与接种法》；NH3-N的测定采用HJ535—2009《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》；总氮的测定：采用HJ 636—2012《水质总氮的测定》中的过硫酸钾消解法；总磷的测定：采用HJ671—2013《水质总磷的测定》中的钼酸铵法。

污水中絮体粒径用Malvern Mastersizer 3000E粒径分析仪测定，D10表示絮体颗粒的累积含量为10%时对应的絮体粒径，其值越小反映细微颗粒越多；D90表示絮体颗粒的累积含量为90%时对应的絮体粒径，其值越大反映大颗粒越多。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选与鉴定结果

2.1.1 菌株的筛选

图1 不同菌株的絮凝效果Fig.1 Flocculation effect of different strains

共筛选到12株产絮菌，依次编号为HN1～HN12。在发酵培养基中在温度32℃、转速120 r/min条件下，培养48 h，并对发酵液的絮凝效果进行测定，结果见图1。分析絮凝率可知，产絮菌HN2、HN5培养发酵液絮凝效果较好，絮凝率分别为69.3%、76.1%。为此，选择絮凝率最高的产絮菌HN5为实验菌株。

2.1.2 菌株鉴定

絮凝效果最好的产絮菌HN5颜色呈乳白色、边缘整洁、表面湿润、微凸、单菌落直径2 mm左右，革兰氏阴性；其16SrDNA序列比对结果见表1。由表1可知，菌株HN5 16S rDNA序列与Ochrobactrum pseudintermedium ADV31（Genbank no.NR043756.1）的相似度最高，为99%，与其余种属的相似性均低于97%。故将HN5菌株初步鉴定为假中间苍白杆菌（Ochrobactrumpseudintermedium）。该种属细菌广泛分布于活性污泥环境，如王丽[19]从活性污泥中分离获得苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）、苏峰等[20]从生活污水站曝气池活性污泥中分离获得Ochrobactrum sp.Azn6.1产絮菌。

表1 菌株HN5的16S rDNA系列比对结果Table 1 Alignment results of 16S rDNA sequence of strain HN5

2.2 白酒废水制备微生物絮凝剂的条件

2.2.1 废水COD对絮凝效果的影响

将白酒废水（COD 20.8 g/L）分别稀释2、3、4、5、6、8倍作为发酵培养基，以菌株HN5预发酵液按2%接种量接入，在32℃、转速120 r/min条件下，恒温培养60 h，考察不同COD浓度对絮凝效果的影响，结果如图2所示。当白酒废水COD为4.2～6.9 g/L时，絮凝率在70.4%以上，其中效果最好为78.4%，此时稀释倍数为4，COD为5.2 g/L。COD浓度太高时有机碳源负荷过高或COD浓度过低时碳源等营养物质不够，都不利于微生物生长并抑制多糖类物质的分泌，而多糖物质是微生物絮凝剂的主要成分[4，21]。

图2 不同COD对絮凝效果的影响Fig.2 Effect of different COD on flocculation

2.2.2 培养时间对絮凝效果的影响

在白酒废水COD 5.2 g/L、32℃、120 r/min培养条件下，考察不同培养时间对絮凝效果的影响，结果如图3所示。随着培养时间增加，絮凝率先增大后减小，培养时间在60 h、72 h、84h时絮凝率分别为78.8%、80.1%、74.2%，在72 h时絮凝率最高，随着培养时间的增大，发酵液中营养物质逐渐消耗，菌体细胞的代谢方向发生变化，粘性有机大分子代谢产物减少，使得微生物絮凝剂活性减弱。因此，发酵培养时间在60～72 h为宜。

图3 不同时间对絮凝效果的影响Fig.3 Effect of different time on flocculation

2.2.3 培养pH对絮凝效果的影响

图4 不同pH对絮凝效果的影响Fig.4 Effect of different pH on flocculation

在白酒废水COD 5.2 g/L、32 ℃、120 r/min条件下，培养60 h后，用HCl和NaOH溶液，调节培养基初始pH值，考察不同pH对絮凝效果的影响，结果如图4所示。结果表明，废水pH值为6、7、8时絮凝效果较好，絮凝率达到72.1%以上，即在弱酸性、中性、弱碱性条件下的絮凝效果较好。原因是培养液pH值会影响氧化还原电位的大小以及有机物的离子化作用，从而影响微生物对营养物质的吸收利用和絮凝物质的分泌；同时生物酶只能在一定pH值下才能发挥高活性，pH值过高或过低都将降低酶的活性。

2.2.4 外加营养物质对絮凝效果的影响

白酒废水COD 5.2 g/L，pH调整为7.0±0.1，在32℃、120 r/min条件下，添加不同量的（NH4）2SO4、KH2PO4，培养60 h，考察不同外加氮、磷量对絮凝效果的影响，结果如图5所示。由图5可知，随着（NH4）2SO4量的增大，絮凝效果变化甚微，说明白酒废水中有足够氮源供微生物所需，不需要外加氮源；随着KH2PO4的添加量增大，絮凝率逐渐变大，当添加量增大到2.0 g/L以后，继续增大投加量，絮凝率增大不明显，KH2PO4的适宜添加量为2.0 g/L。

图5 外加物质对絮凝效果的影响Fig.5 Effect of additional nutrient on flocculation

2.3 对生活污水的处理效果

在白酒废水COD 5.2 g/L、KH2PO42.0 g/L、培养基初始pH值7.0±0.1、32℃、120 r/min条件下，培养60 h后，向100 mL生活污水中加入不同体积发酵培养液，其絮凝效果及对COD、悬浮物（SS）、氨氮（NH3-N）去除率结果如图6所示，絮凝率最高时污水中絮体粒径如图7所示。

由图6可知，HN5产絮菌发酵培养液对生活污水絮凝和SS去除有很好的效果，并且随着发酵液投加量的增加，其去除率先增大后减少，絮凝剂投加量为6 mL/100 mL时，絮凝效果最高为86.8%、SS去除率高达92.5%。COD的去除率低于SS的去除率；随着发酵液投加量的增加，NH3-N去除率未出现规律性增加，且去除率均低于20%。这是因为生活污水中有大量溶解性COD，以及污水中NH3-N为溶解性的，而絮凝对溶解性物质没有显著去除效果。SS的高去除率和高絮凝效果，说明微生物絮凝剂对胶体、悬浮物形成絮体起到了正效应，能有效加强悬浮物、胶体物及微生物絮凝剂之间的相互作用，促进架桥联接和大颗粒絮体形成进而增强絮凝效果；但随着絮凝剂投加量的进一步增加，会在水中形成反电位而使絮凝效果下降[7，22]。由图7可知，加入了微生物絮凝剂的污水D10较小，说明细微颗粒所占的比例高于空白污水；投加絮凝剂后，污水D90对应的粒径开始时大于未投加絮凝剂的污水，沉降一定时间后，小于空白污水，说明加入絮凝剂后，促进了絮体的形成，且生活污水中形成的絮体颗粒易于沉降，进而表明菌株HN5产生的絮凝剂适宜于生活污水的絮凝处理，能有效去除悬浮物。

图6 菌株发酵培养液对生活污水处理的效果Fig.6 Effect of fermentation medium on domestic sewage treatment

图7 生活污水中絮体粒径Fig.7 Flocs size in domestic sewage

3 结论

从活性污泥中分离获得的产絮菌HN5，经鉴定为假中间苍白杆菌（Ochrobactrum pseudintermedium），培养产生的发酵液具有较好的絮凝效果，对高岭土悬浊液絮凝率最高可达84.9%。

利用白酒酿造废水作为替代培养基，产絮菌HN5发酵液仍具有较高的絮凝率，影响其絮凝效果的主要因素包括白酒酿造废水COD、培养时间、培养基pH值、外加磷源；适宜的培养条件为COD 5.0～6.9 g/L，培养时间60～72 h，pH值6～8，KH2PO42.0 g/L。

用产絮菌HN5发酵液处理生活污水，当絮凝剂投加量为6.0 mL/100 mL时，效果最好，絮凝率达到86.8%、SS去除率高达92.5%。白酒酿造废水用于产絮凝菌的培养，微生物絮凝剂具有较高的絮凝效果。