葛祎楠，邹 静*，李 斌，常学东

（1.河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎 066600；2.河北省板栗工程技术研究中心，河北 昌黎 066600）

板栗（Castaneamollissima）是我国最早栽培的树木之一，因为主要生长在山地，因此作为退耕还林的主要树种，在山地地区广泛种植，且种植数量逐年上升[1]。板栗除了富含多种营养物质外，还富含淀粉[2-3]。由于板栗极不耐贮存，如果不及时加工，会造成大量的损失。在国外，板栗很少作为食品原料销售，通过不同的加工方式生产板栗产品，主要有板栗酱、板栗粉、板栗乳、板栗膏、板栗果茶等[4]。而国内板栗主要以食品原料销售，深加工方法较为单一，产品种类较少，且存在货架期较短、附加值较低的问题[5]，因此板栗产业中的“丰产不丰收”和“卖栗难”问题日益凸显[6-7]，这既造成板栗资源的浪费又挫败了栗农的积极性，因此开发板栗深加工技术成为解决板栗供大于求现状的根本途径。

由于板栗富含淀粉又营养丰富，因此可以将其作为酿酒原料。我国幅员辽阔，虽然酒水种类较多，但主要是由啤酒、葡萄酒、黄酒及白酒组成。其中，黄酒的营养价值最高，氨基酸含量丰富[8]，具有活血祛寒[9]、抗衰护心[10]、减肥、补益气血、抗氧化的功效[11-13]。但由于其独特的酿造工艺，造就了黄酒的口感厚重、浓郁，影响了黄酒的销售。而与黄酒相媲美的日本清酒，在口感上却优于黄酒。虽然清酒的酿造工艺是源于黄酒，但是清酒在酿造过程中，以米曲为糖化曲[14]，并控制大米的碾白精度[15]，因此口感比较清淡、色泽淡黄，比较适合大众的口味，且极易与菜肴配伍。

本研究以实验室保藏的4株糖化用米曲霉（Aspergillus oryzae）为曲种，通过测定α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶的酶活力以及酒曲的感官评价，筛选一株米曲霉（A.oryzae）作为酿造板栗大米清酒的糖化曲种，参照日本纯米清酒工艺制作板栗大米清酒，并对所酿新酒的氨基酸成分进行分析，测定氨基酸种类及含量，为板栗大米清酒实际产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：吉林龙羲米业有限公司；燕龙板栗：河北迁安；米曲霉（Aspergillusoryzae）2011、2053、3005以及2038，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：本实验室保藏。

3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：北方试剂有限公司；碘酸钾（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；酪氨酸（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV5000紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；L530型离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；LXBZX120M型保湿保温培养箱：力德生物科技（上海）有限公司；L-8900氨基酸自动分析仪：日本日立高新技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酒曲的制备[16]

米曲霉斜面制备：按1∶4的比例，将米曲加入水中，55℃糖化3～4 h，然后煮沸过滤，调节糖度为10°Bx，将调节好的米曲汁倒入茄子瓶，添加2%琼脂，115℃灭菌20 min，取出，冷却，摆好斜面。无菌条件下，用接种铲将斜面内的米曲霉点接到茄子瓶斜面中，30℃条件下培养5 d。

酒曲的制备：取大米500 g，用凉开水按照1∶1比例浸泡，直至用手可以轻易将米碾碎时，将大米沥干，用蒸锅蒸米，等蒸汽出现8 min后熄火（要求米粒有弹性但不黏手）后摊开晾凉。在无菌条件下，将无菌水倒入米曲霉斜面，充分振荡后得到孢子液，将孢子液倒入到已经晾凉的米饭当中，搅拌均匀后，30℃条件下恒温培养，待表面呈现孢子时取出，在50℃烘干，备用。

1.3.2 板栗大米清酒工艺流程及操作要点[17-18]

操作要点：板栗大米清酒酿造时，首先将板栗去壳后分成大米粒大小颗粒。大米与水按1∶2的比例浸泡24 h，沥干后与板栗混匀。板栗与大米（浸泡前）按1∶9比例混合后进行蒸15 min，晾凉。接曲量为原料质量的10%，拌曲后30℃培养1d接入酵母菌，保温培养12h后，按1kg原料加入1.41kg水的比例加水，20℃酿造20 d。加水后前7 d每天搅拌2次，7 d后封缸直至20 d，过滤压榨得到新酒。酿造过程中原料、米曲分3次投入发酵罐中，低温（20℃）发酵后经过滤除菌后得到新酒。

1.3.3 分析检测[19-21]

（1）α-淀粉酶活力的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定米曲中α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶活力单位定义：1 g干米曲在60℃、pH 6条件下，1 min从可溶性淀粉中释放出1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位（U/g）。

（2）糖化酶活力的测定

采用次碘酸钾法测定米曲的糖化酶活力。

糖化酶活力单位定义：1 g干米曲于40℃，pH 4.6条件下，1h分解可溶性淀粉，产生1 mg葡萄糖所需的糖化酶量为1个酶活力单位（U/g）。

（3）蛋白酶活力测定

采用紫外分光光度法测定酸性条件下米曲中的蛋白酶活力。

蛋白酶活力单位定义：1 g干米曲，在40℃、pH 4.5条件下，在1 min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的蛋白酶量为一个酶活力单位（U/g）。

（4）氨基酸含量及种类测定

吸取酒样10.0 mL，置于50.0 mL容量瓶中，加入5%三氯乙酸20 mL，摇匀，加水稀释至刻度，摇匀，于微孔漏斗上过滤，吸取滤液，直接装样于日立L-8900氨基酸自动分析仪上，测定除色氨酸外的其他氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 四种米曲霉酒曲感官比较

酒曲被比喻为“酒之骨”，它除了将淀粉分解成单糖外，在赋予酒各种风味方面也起着至关重要的作用。按照1.3.1方法制备4种米曲霉的酒曲，整个培养过程中酒曲感官变化情况见表1。

表1 米曲霉纯种接种后4种酒曲感官评价Table 1 Sensory evaluation of 4 kinds of Jiuqu after pure inoculation with Aspergillus oryzae

由表1可知，米曲霉2011成曲后的口感香甜，且香气明显。米曲霉2053成曲后米饭易板结，不利于微生物的生长。米曲霉2038和3005的成曲酱香味较浓，会影响发酵后酒液口感。因此从酒曲表观、口感和气味等方面对4种米曲霉进行综合评价，其成曲优劣排序为米曲霉酒曲2011＞2053＞2038＞3005。

2.2 四种米曲霉酒曲酶活力比较

2.2.1 四种米曲霉酒曲α-淀粉酶活力比较

以四种米曲霉为曲种，制备酒曲，培养过程中每隔12h测定一次，四种米曲霉酒曲的α-淀粉酶酶活力测定结果见图1。

图1 4种米曲霉酒曲α-淀粉酶酶活力比较Fig.1 Comparison ofα-amylase activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由图1可知，随着培养时间的延长，4种米曲霉酒曲的α-淀粉酶酶活力逐渐增强。其中米曲霉2011的淀粉酶活力最强为1 306.63 U/g，米曲霉2053次之为1 059.16 U/g；而米曲霉2038和米曲霉3005的α-淀粉酶活力相对较弱。

2.2.2 四种米曲霉酒曲糖化酶活力比较

糖化酶活力的高低，决定原料的最终出酒率。四种米曲霉酒曲的糖化酶活力测定结果见图2。

图2 4种米曲霉酒曲糖化酶酶活力比较Fig.2 Comparison of glucoamylase activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由图2可知，四种米曲霉酒曲的糖化酶活力随着培养时间的延长而增大。四种米曲霉酒曲中，米曲霉酒曲2053的糖化酶活力最大，培养84 h时，酶活力达到392.2 U/g，米曲霉酒曲2011的糖化酶活力次之，培养84 h时达到峰值为324.56U/g；米曲霉3005和米曲霉2038的糖化酶活力最弱。培养84h分别为140.32 U/g干质量和74.25 U/g。

2.2.3 四种米曲霉酒曲蛋白酶活力比较

酸性环境下，4种米曲霉酒曲的蛋白酶活力，结果见图3。

图3 4种米曲霉酒曲蛋白酶酶活力比较Fig.3 Comparison of protease activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由图3可知，随着培养时间的延长，4种米曲霉酒曲的酶活力均逐渐增加。4株霉菌中米曲霉2038酒曲的蛋白酶活力最强，培养到84h时，酶活力达到3262.94U/g，其次为米曲霉3005酒曲。而米曲霉2011和2053酒曲的蛋白酶活力最弱，培养到84 h时，酶活力分别为1 036.33 U/g和1 568.68 U/g。蛋白酶除提高出酒率，缩短发酵周期，有助于香味物质的形成的作用外，还可以降低酒液中杂醇油含量。但研究表明[23]，酸性条件下蛋白酶能阻断生淀粉对淀粉酶的吸附，并会破坏嗜杀酵母的嗜杀代谢基因，而失去对野生酵母的杀伤力。因此，在酿酒工业需要控制蛋白酶含量，确保蛋白酶含量适中，从而保证淀粉正常分解。

由于酒曲要求具有较强的液化酶活力、糖化酶活力以及一定的酸性蛋白酶活力，因此综合成品酒曲的口感评价以及3种酶活力，最终选定米曲霉2011为最终的糖化酒曲。

2.3 板栗大米清酒和纯大米清酒中氨基酸种类及含量比较

按照日本纯米清酒工艺分别酿造板栗大米清酒和纯大米清酒，采用氨基酸测定仪分别测定了两款酒中氨基酸的种类及含量，结果见表2。

由表2可知，两种清酒中都含有丰富的氨基酸，蛋白质含量是衡量食品营养的重要指标之一，板栗中的蛋白质占5%～11%[24]，高于大米蛋白质含量4.8%～9.1%[25]。因此在原料相同的条件下，添加10%的板栗可以使酒中的氨基酸含量明显增加。板栗大米清酒中检测出的17种氨基酸（含8种必需氨基酸）含量均高于大米清酒中的氨基酸含量，其中天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是大米清酒的2倍以上。板栗中的赖氨酸等必需氨基酸的含量超过联合国粮食及农业组织（food and agricultureorganization of theunited nations，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）的标准[26]，同时就豆类和禾谷类中限制氨基酸而言，板栗蛋白可以改善其摄入量不足，完善膳食营养结构。同时适当提高氨基酸含量，有助于改善酒液风味、改良酒质。因此添加板栗既改良了清酒的营养价值，又改善了其风味。

表2 纯米清酒和板栗大米清酒中氨基酸的种类及含量比较Table 2 Comparison of the types and contents of amino acids between rice sake and Chinese chestnut-rice sake

3 结论

根据4种米曲霉所制酒曲的感官评价以及对液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶活力的分析，最终确定米曲霉2011为板栗大米清酒的糖化曲，其α-淀粉酶活力、糖化酶活力及酸性蛋白酶活力分别为1 306.63 U/g干质量、324.56 U/g干质量、1 036.33 U/g干质量。板栗大米清酒中共检出17种氨基酸，其中包含8种人体必需氨基酸，板栗的添加使得清酒中氨基酸的含量显著增加，其中有9种氨基酸（天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的含量是大米清酒中的2倍以上，板栗适合作为酿酒原料，适当添加板栗不仅可以提高清酒的营养价值，对清酒风味有一定的好处。