姜春宇，张 媱，孙燕飞，李 杨，雷勇辉*

（1.石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832003；2.石河子大学 农学院，新疆 石河子 832003）

蛋白酶是世界三大工业用酶之一，可催化肽链中肽键水解，在食品、洗涤、皮革等工业领域发挥着举足轻重的作用，市场占有率高达整个商品酶销售量的一半以上[1-2]。蛋白酶作为常用工业酶之一，在市场上享有广阔的应用及开发前景，并受到研究人员的广泛关注：刘颖等[3]通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）10075发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化，中性蛋白酶活力由98.36 U/mL提高至353.45 U/mL；舒伟学等[4]通过基因组改造技术对一株具有角蛋白酶活性的节杆菌（Arthrobacter）进行改造，酶活力为原始菌株的5.48倍。低温蛋白酶的最适温度一般在40℃以下[5]，由于在低温环境下具有较高的酶活性，有助于在保证催化效率的前提下降低反应温度和缩短反应时间，从而大幅度节约能源，具有广泛应用前景以及中温蛋白酶无法取代的优越性[6]，自20世纪70年代以来，国际上越来越多的实验室投入到低温蛋白酶的研究，从海水、高山以及极地泥土等样品中分离到产低温蛋白酶的菌株，如张晓燕[7]从新疆冰川高寒地区阿勒泰进山口植物根际冻土中分离出一株沙雷氏菌（Serratiamarcescens），其所产的低温蛋白酶活力为54.25 U/mL。

目前，蛋白酶主要来源于细菌，其中以芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonadaceae）尤为突出[8]。但其生产菌株的单一性不但不能满足制革、丝绸、日化工业对多种酶类生产的需求，而且芽孢杆菌在工业生产过程中产生的芽孢往往影响产品的产量和质量。因此，打破现有产酶菌种的局限性，积极开发新菌种势在必行。酵母菌作为一种工业常用菌种，在生产上具有发酵工艺成熟、产物易于诱导、产品质量优良等特点。徐亚男等[9]在新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中筛选得到1株产蛋白酶能力较强的葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniasporauvarum）；DASKAYA-DIKMEN C等[10]于土耳其北部分离得到3株嗜冷酵母（Candidagelida），其蛋白酶酶活在2.11～10.53 U/mL范围内。

本研究从新疆本地分离获得的200株酵母菌中筛选产低温蛋白酶菌株，并对其中3株低温蛋白酶活力较高的酵母菌进行鉴定，并利用响应面法对低温蛋白酶活力最高的菌株产蛋白酶发酵培养基配方进行初步优化，为后续酵母产低温蛋白酶的研究和应用奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

200株酵母菌株：实验室从新疆本地水果表皮、植物内部、水样和土壤中分离得到。

1.1.2 培养基

种子液体培养基：采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptonedextrose，YEPD）培养基。酵母粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，pH自然。121℃灭菌20 min。

蛋白酶平板筛选培养基[11]：在YEPD培养基基础上添加脱脂奶粉1.0%，混匀，为防治奶粉变性应将培养基分别高压灭菌。121℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

酪氨酸、干酪素、福林酚（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；DP307酵母基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司；Taq酶（5 U/μL）：大连TAkaRa公司。

1.2 仪器与设备

CS601恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；759S紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；ZHWY-100B摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；HWS恒温恒湿培养箱：上海精宏实验设备有限公司；FroFleX聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Life Technologies公司；5424R高速冷冻离心机：Eppendorf中国有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化设备有限公司；SMZ800N体式镜：日本Nikon公司；Imager.M2微分干涉显微镜：德国ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 产低温蛋白酶酵母菌株的筛选

初筛[12]：室温下将分离纯化得到的酵母菌点接于蛋白酶平板筛选培养基上，于28℃恒温培养7～14d后观察菌落生长状况与培养基变化情况。记录有透明水解圈的酵母菌，编号并拍照，采用十字交叉法记录水解圈直径（D）与菌落直径（d）的比值D/d。将具有透明水解圈的菌株点接转板，于20℃重复上述观察记录过程以筛选产低温蛋白酶酵母菌。

复筛[13-15]：在超净台中，于活化斜面取一环初步筛选得到的产低温蛋白酶酵母菌株接种到100 mL种子液培养基中，在20℃或28℃（依据初筛培养温度）、150 r/min的恒温摇床中培养48 h。取2 mL种子液，10 000 r/min离心20 min，所得的上清液即为粗酶液。粗酶液稀释10倍后，根据国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》测定蛋白酶活力，其中反应温度降至20℃或28℃。

1.3.2 形态学和生理生化鉴定

形态学鉴定：将筛选到的产低温蛋白酶的菌种划线接种于YEPD培养基平板上，28℃培养2～5 d，进行菌落形态观察，并在体视显微镜和微分干涉显微镜下进行细胞形态观察。

生理生化鉴定：鉴定方法参考文献[16]。

1.3.3 分子生物学鉴定[17-18]

酵母菌基因组的提取：采用DP307酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌株的DNA。

PCR扩增：以酵母菌基因组DNA为模板，采用26SrRNA基因的通用引物（NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAG GAAAAG-3'；NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系：50×SYBRGreen 0.3μL、ROX Reference Dye0.1μL、10×cDNA 1μL、10×Taq buffer 2.5μL、25 mmol/L MgCl22.5μL、10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）0.5 μL、5 U/μL Taq DNA polymerase0.2μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL，补双蒸水（ddH2O）至总体积25μL。PCR反应条件：95℃1min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 10 min。

测序及系统发育树分析：将扩增出的26SrRNA基因序列克隆送至上海生工测序。登录美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站，采用BLAST程序进行序列比对，通过Mega6.06软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统进化树，进行系统发育树分析。

1.3.4 产低温蛋白酶酵母菌株发酵培养基的优化

碳源种类优化：于活化斜面取一环初步筛选得到的产低温蛋白酶酵母菌株WLY1接种至100mL种子液体培养基中，20℃、150r/min条件下培养48h得到种子液。按2%（V/V）接种量将种子液接种至YEPD培养基中，20℃、150 r/min条件下培养时间48h。以不添加葡萄糖的YEPD培养基为对照，考察碳源种类（蔗糖、甘油、乳糖、可溶性淀粉、柠檬酸）对酵母菌株WLY1产低温蛋白酶的影响，碳源添加量为2%。

无机氮源种类优化：选取最优碳源后，考察无机氮源种类（酪素、硝酸钾、硝酸钠、尿素粉）对酵母菌株WLY1产低温蛋白酶的影响，无机氮源添加量为1.5%[19-21]。

响应面分析[22]：在前期单因素试验的基础上，利用响应面分析法（responsesurfacemethodology，RSM）中的Box-Behnken试验方案进行设计，考察酵母浸粉含量（A）、蛋白胨含量（B）和干酪素含量（C）对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，初步确定最优发酵培养基配方，并进行验证。

1.3.5 数据处理

用Excel 2013计算样品的平均值±标准差，用SPSS19.0软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan法进行组间多重比较。

2 结果与分析

2.1 产低温蛋白酶酵母菌株的筛选结果

产低温蛋白酶酵母菌的D/d值及酶活力测定结果见表1。表中除菌株WLY1、WLY1、MLY1于20℃条件下培养外，其他菌株均在28℃条件下培养。

表1 不同菌株的D/d值、蛋白酶活力测定结果Table 1 Determination results of D/d values and protease activity of different strains

由表1可知，从新疆本地分离获得的200株酵母菌中筛选出14株产低温蛋白酶的菌株，其中菌株WLY1、WLY2和MLY1在20℃条件下均能产蛋白酶，蛋白酶活分别为69.03 U/mL、34.20 U/mL、29.70 U/mL，故选取该3株酵母菌进行菌种鉴定。且在3株酵母菌株中，菌株WLY1在20℃条件下所产的低温蛋白酶酶活力较高。因此，对其产低温蛋白酶发酵培养基配方进行优化。

2.2 产低温蛋白酶酵母菌株的鉴定

2.2.1 形态观察

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的菌落形态及细胞形态观察结果见图1。

图1 产低温蛋白酶酵母菌WLY1、WLY2和MLY1的菌落（A，B，C）和细胞形态（a，b，c）Fig.1 Colony(A,B,C)and cell morphology(a,b,c) of low-temperature protease-producing yeasts WLY1,WLY2 and MLY1

由图1可知，菌株WLY1菌落呈粉红色，圆形，中间凸起，表面及边缘光滑湿润，其单细胞为椭圆形或球形，可观察到出芽生殖形成的藕节状假菌丝；菌株WLY2菌落呈白色、圆形，中间凸起，表面及边缘粗糙规整，其单细胞成典型球状；菌株MLY1菌落呈米黄色，表面润滑，中部凹陷有褶皱，边缘凸起不规则，其单细胞体积较小，椭圆形或球形，单个或成对出现。

2.2.2 生理生化特征

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的生理生化鉴定结果见表2～表4。

表2 3株产低温蛋白酶酵母菌的同化试验结果Table 2 Results of assimilation tests of 3 yeasts producing low-temperature protease

表3 3株产低温蛋白酶酵母菌糖发酵结果Table 3 Results of the sugar fermentation tests of 3 yeasts producing low-temperature protease

表4 3株产低温蛋白酶酵母菌其他生理生化鉴定结果Table 4 Identification results of other physiological and biochemical of 3 yeasts producing low-temperature protease

由表2～表4可知，菌株WLY1不能利用乳糖、淀粉以及蜜二糖作为碳源，在无维生素环境下可以生长，不产胞外类淀粉化合物，产尿素酶，可在40℃条件下生长；菌株WLY2不能利用D-阿拉伯糖、蜜二糖以及菊粉作为碳源，在无维生素环境下可以生长，产胞外类淀粉化合物、尿素酶，可在40℃条件下生长；菌株MLY1在上述3种菌株中的可利用碳源最少，生长需要维生素，产胞外类淀粉化合物、尿素酶，最高生长温度仅28℃。

经形态观察和生理生化鉴定，初步鉴定菌株WLY1、WLY2、MLY1分别为红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球菌属（Cryptococcus）、Barnettozyma。

2.2.3 分子生物学鉴定

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的26SrRNA测序结果在NCBI上进行BLAST比对搜索，选取同源性较高的菌株构建系统发育树，结果见图2。

图2 3株产低温蛋白酶酵母菌基于26S rDNA的D1/D2区序列构建的进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 3 yeasts producing low-temperature protease based on the D1/D2 sequences of 26S rDNA

由图2可知，菌株WLY1、WLY2和MLY1分别与红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、Barnettozyma聚于一支，初步判定酵母菌株WLY1为Rho dosporidium、WLY2为Cryptococcus、MLY1为Barnettozyma。结合形态学和生理生化鉴定结果，最终鉴定产低温蛋白酶酵母WLY1、WLY2、MLY1分别为双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、Cryptococcus adeliensis、Barnettozymacalifornica。

2.3 菌株WLY1产低温蛋白酶发酵培养基配方优化

2.3.1 碳源种类对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响

以YEPD培养基为对照，考察碳源种类对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响，结果见图3。

图3 碳源种类对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响Fig.3 Effect of type of carbon source on low-temperature protease production by strain WLY1

由图3可知，在不添加葡萄糖的YEPD培养基中，菌株WLY1产蛋白酶水平最高，达72.49 U/mL。因此，本试验选则无葡萄糖添加的YEPD培养基为最佳培养基。

2.3.2 无机氮源种类对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响

在无葡萄糖添加的YEPD培养基基础上，考察无机氮源种类对菌株WLY1产蛋白酶的影响，结果见图4。

图4 无机氮源种类对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响Fig.4 Effect of type of inorganic nitrogen source on low-temperature protease production by strain WLY1

由图4可知，采用添加有干酪素的培养基进行发酵，菌株WLY1所产的低蛋白酶活力最高，为102.20 U/mL，因此选用在无葡萄糖添加的YEPD培养基基础上添加干酪素为最佳培养基。

2.4 响应面分析结果

通过前期单因素试验得出，三种氮源的最优添加量均为1.5%，因此，以单因素为基础进行响应面试验。以蛋白酶活力（Y）为响应指标，考察酵母浸粉（A）、蛋白胨（B）和干酪素（C）对菌株WLY1产低温蛋白酶的影响，Box-Behnken响应面优化试验结果见表5，方差分析结果见表6，各因素交互作用对蛋白酶活力的影响结果见图5。

表5 Box-Behnken试验设计与结果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests

表6 回归模型的方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

通过Design Expert软件对表5试验数据进行二次多项式回归拟合，获得蛋白酶活力（Y）对酵母浸粉（A）、蛋白胨（B）和干酪素（C）的二次多项式回归方程：

图5 酵母浸粉、蛋白胨和干酪素交互作用对菌株WYL1的低温蛋白酶活力影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between yeast extract powder,peptone and casein contents on low-temperature protease activity of strain WYL1

由表6和图5可知，3个因素的二次项及蛋白胨对蛋白酶活力的影响极显著（P＜0.01）；酵母浸粉分别与蛋白胨、干酪素的交互作用对蛋白酶活力影响显著（P＜0.05）；其他因素对蛋白酶活力影响不显著（P＞0.05）。分析该二次多项模型及其各项的方差结果表明，该回归模型的P值为0.000 6，极显著（P＜0.01），变异系数（coefficient of variation，CV）值较低为12.81%，有效信号与噪声的比值＞10.95，决定系数R2值达到0.956，说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，因而该模型可以用于菌株WLY1产低温蛋白酶酶发酵培养基优化的理论分析和预测。

通过响应面优化得出酵母菌株WLY1产低温蛋白酶的最佳培养基配方为酵母浸粉1.64%、蛋白胨1.21%、干酪素1.48%。在此最优条件下，得出实际蛋白酶活力平均值为251.51 U/mL，与预测值248.01 U/mL接近，说明模型可靠性很高。

3 结论

本研究从新疆本地分离获得的200株酵母中筛选出14株产低温蛋白酶的酵母菌株。其中3株酵母（WLY1、WLY2和MLY1）在20℃条件下产蛋白酶，且蛋白酶活力依次为69.03 U/mL、34.20 U/mL、29.70 U/mL。通过形态观察、生理生化和分子生物学鉴定菌株WLY1、WLY2和MLY1分别为双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、Cryptococcus adeliensis、Barnettozyma californica。通过响应面分析法，优化得出菌株WLY1产低温蛋白酶的最佳培养基配方为酵母粉1.64%、蛋白胨1.21%、干酪素1.48%。在此最优条件下，蛋白酶活力为251.51 U/mL，约为优化前（69.03 U/mL）的4倍，具有较大的蛋白酶潜在应用价值。