李新果，史志斌，张 磊，赵小月,王玉国，石 昂，时庆贺，陈 陆

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPS)在中国、澳大利亚、美国、英国等世界多国普遍流行，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，临床上多与PRRSV、PCV-2等混合感染，给养殖业带来巨大损失，已经成为危害养殖业的重要细菌性病原[1-4]。HPS血清型众多，且在地域和时间上存在差异，中国主要流行的血清型为4、5、7、13型和不可分型(NT)[5]。因此，对不同时间、不同区域的HPS分离鉴定，尤其是对分离株血清型鉴定，对预防HPS至关重要。

目前，基因分型法成为鉴定HPS血清型的主要方法。常用的基因分型法为多重PCR分型法，与过去常用的分型方法琼脂扩散试验相比，方便快捷且不易受外界因素干扰，可提高对不可分型菌株的鉴别[4-7]。

为了解HPS在河南省的感染和流行情况，对2017—2018年河南省不同地区养殖场的送检疑似病料，进行HPS分离鉴定及血清学分型，旨在为副猪嗜血杆菌病的预防和治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 于2017年1月—2018年1月，采集来自南阳、新乡、商丘、焦作、鹤壁、洛阳、开封、登封等地区的10个大型养殖场的疑似病猪脾脏、肺脏、关节、肝脏和脑组织病料，共45份。

1.1.2 主要试剂 巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板为郑州安图生物工程有限公司产品；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)为美国BD公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为Sigma公司产品；新生犊牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品；TaqDNA 聚合酶、DL1000 DNA Marker为大连宝生物工程有限公司产品。

1.1.3 标准菌株 SH0165株由华中农业大学馈赠，金黄色葡萄球菌阳性菌株由河南农业大学传染病实验室保存。

1.1.4 引物 参照Oliveira等[8]的方法，根据HPS 16S rRNA (M75065)的基因序列设计种特异性鉴定引物F/R。

F:5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，R:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。预期扩增的片段大小为821 bp。参照Howell等[6]和Jia等[7]的报道，合成用于鉴定HPS血清型的引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。

表1 HPS血清型鉴定多重PCR引物及扩增目的基因片段大小

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养 剖检疑似病猪，无菌条件下取肝脏、肺脏、脾脏、胸膜积液和关节液等病料，接种于巧克力琼脂平板上，37 ℃培养24～48 h。无菌条件下挑取光滑圆润、无色透明的露珠样菌落进行革兰氏染色，镜检，并挑取镜检可疑的单个菌落，再次接种巧克力琼脂平板纯化，备用。

1.2.2 病原菌DNA提取及PCR鉴定 挑取纯化后的单菌落，溶于30 μL单蒸水中，混匀后，煮沸法提取细菌基因组DNA[9]。PCR扩增方法按Oliveira等[8]的方法进行。

1.2.3 病原菌卫星试验 将PCR检测HPS为阳性的可疑菌落水平划线于绵羊鲜血麦康凯琼脂平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37 ℃培养24～48 h，观察是否出现卫星生长现象。

1.2.4 病原菌血清型鉴定 根据Howell等[6]和Jia等[7]建立的多重PCR方法，鉴定HPS的血清型。煮沸法制备待测菌株基因组DNA，按照表1的引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL:TaqDNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，待检DNA 2 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL，80 V电压2%琼脂糖凝胶电泳1 h，AlphaImager Ep型成像仪拍照保存。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离培养结果

将病料接种于含NAD的巧克力琼脂平板，37 ℃培养48 h后，观察到1～2 mm左右针尖大小、灰白色半透明、圆润的菌落(图1)。单个菌落涂片进行革兰氏染色后在显微镜下观察，结果为革兰氏阴性细小杆菌，有细长、杆状的菌体(图2)。

图1 病原菌在巧克力琼脂平板的菌落形态

图2 病原菌革兰氏染色镜检结果(1 000×)

2.2 病原菌PCR鉴定结果

对2.1中筛选获得的12株疑似HPS菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增，12株菌株均能扩增出预期821 bp的目的条带，且与标准株SH0165位置一致(图3)，鉴定为HPS阳性，初步确定为HPS。

M:DL1000 DNA Marker; 1:LY-1株; 2:ZJ-1株;

2.3 病原菌卫星试验结果

分离HPS菌株离金黄色葡萄球菌菌苔越近的菌落长势越好，越远的菌落越小甚至未出现菌落，呈卫星生长现象(图4)。

2.4 病原菌多重PCR鉴定血清型结果

对HPS LY-1、NY-1株等12株分离株进行血清型鉴定，结果见图5。由图5可知，HB-1、XX-3株扩增出约180 bp的目的片段，与funB基因大小一致，鉴定为血清1型；XX-4株扩增出约295 bp的目的片段，与wzx基因大小一致，鉴定为血清2型；JZ-1株扩增出约320 bp的目的片段，与wciP基因大小一致，鉴定为血清4型；LY-1、KF-1、DF-1、XX-2株扩增出约450 bp的目的片段，与wcwK基因大小一致，鉴定为血清5型；XX-1、SQ-2株扩增出约490 bp的目的片段，与funQ基因大小一致，鉴定为血清7型；NY-1株扩增出约840 bp的目的片段，与gltP基因大小一致，鉴定为血清13型。SQ-1株未能扩增出任何片段，鉴定为不可分型(NT)。HPS分离株详细信息见表2。

1:金黄色葡萄球菌；2:HPS

M:DL1000 DNA Marker; 1:HB-1株; 2:XX-4株;

表2 病原菌分离株命名、来源、血清分型

3 结论与讨论

HPS是一种革兰阴性细菌且具有宿主特异性，是猪革拉瑟氏病的病原菌，在临床上常引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身感染性疾病[10-11]。近年来，由HPS感染导致猪革拉瑟氏病的发病率和死亡率显著上升，给养猪业造成巨大的经济损失。猪革拉瑟氏病在临床诊断中十分常见，但其病原菌的分离比较困难，原因主要有以下3个方面：病料方面，从病料中分离该菌的最佳时间是12 h内，但临床分离一般都会超过最佳分离时间，所以不易分离病原菌，且病料采集部位也会影响分离率； HPS生长特性方面，该菌生长条件严苛，培养基中必须添加NAD和血清才能生长，培养48 h菌落才明显可见，且在分离培养时，易被其他细菌掩盖或污染，导致分离失败；临床药物使用方面，临床上对于副猪嗜血杆菌病的防治大多会使用抗生素，对于使用过抗生素的病猪，更不易分离病原菌。本研究针对以上原因，采取了以下方法分离HPS，采集HPS易感染的肺支气管和淋巴结等部位的新鲜病料，并且分离时要避免污染；分离培养时，初步分离使用巧克力琼脂培养基，挑取灰白色圆润针尖状菌落进行纯化，纯化后镜检再进行PCR扩增鉴定。

HPS经典血清型分型方法是琼脂扩散试验，但由于阳性血清不易制备，不可分型比率高，所以逐渐被多重PCR分型方法取代。Ma等[5]在2016年运用多重PCR方法和琼脂扩散法对中国分离株进行血清型分型，两者分型结果一致，主要流行菌株血清型是4、5、7、13、NT型(不可分型)，且多重PCR分型方法明显降低NT的比率。Jia等[7]在2017年运用经典分型法和多重PCR分型法对2007—2015年南方HPS分离株进行血清型鉴定，结果表明，这2种方法鉴定的主要流行血清型结果一致，南方流行血清型为2、4、5、12、13、NT型。魏兴良[11]等于2013年对四川省HPS进行分离鉴定，结果显示，四川存在血清型有4、5、10、12、13、NT型。王乐[3]研究表明，河南省2010—2012年流行菌株血清型是4、5、12、13、14型。本研究分离的HPS血清型为1、2、4、5、7、13型，其中1型、5型和7型为主要血清型，与2016年国内流行菌株相比，河南省存在血清型1型和2型，与2014年河南省流行趋势相比，5型依旧为主要血清型，但也存在差异，强毒血清型1型为新增流行血清型，中等毒力血清型2型，不致病血清型7型也都存在。本研究结果表明，除5型外，1型可能为河南省HPS血清型新的流行趋势。近几年，血清7型的临床分离率也逐渐升高[12-13]，Ma等[5]从发生副猪嗜血杆菌病的临床病例中分离到了血清7型，之前研究表明，血清7型为不致病血清型，其致病特性有待进一步研究[12]。

本研究从河南省采集的病料中成功分离12株HPS，血清型分别是1、2、4、5、7、13、NT型，不同地区血清型不同，证实了HPS血清型存在区域性，提示要针对本地区流行菌株的血清型使用对应的疫苗，从而进行有效的预防和治疗。