莫艳秀,陈淑娟,范云鹏,李木兰,张 鹏,刘文彬,肖亚梅*

（1.湘南学院基础医学院,中国湖南郴州423000;2.省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,中国湖南长沙410081;3.湖南师范大学生命科学学院,中国湖南长沙410081）

人恶性睾丸生殖细胞瘤是最常见的睾丸恶性肿瘤,在男性恶性肿瘤中占1%～2%左右,其恶性程度高,近年来发病率有持续上升的趋势,多好发于15～35岁[1]。目前,睾丸癌治疗中面临的最大问题是患者经过药物化疗之后,l成不良预后,容易引起不育等副作用,严重影响了病人的生活质量[2]。在恶性睾丸生殖细胞瘤临床治疗中,顺铂（cisplatin,CDDP）作为经典的一线化疗药物,引起耐药是l成肿瘤细胞化疗失败的主要原因。因此,探索化疗耐药形成原因并寻找相应的防治方法,对于深入理解肿瘤患者化疗耐受的根本原因以及实现人恶性睾丸生殖细胞瘤的治疗有着重要的意义。

肿瘤组织中通常存在着少量具有自我更新和多向分化潜能生物特性的细胞,这类细胞具有无限增生的潜在能力,在肿瘤的发生、转移、侵袭、复发和耐药中具有重要的作用,被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）[3～5]。新近研究发现,胚胎样干性基因Sox-2、Oct-4和Nanog在多种肿瘤中呈现异常表达,在肿瘤干细胞的干性维持中发挥着关键作用,并与肿瘤的发生发展和耐药性密切相关[6～8]。相关研究显示CSCs的耐药机制与ATP结合盒G超家族成员2（ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2）的异常表达也有关[9]。ABCG2是目前研究常用的肿瘤干细胞耐药靶标,它能使许多药物对肿瘤干细胞的杀伤作用明显减弱[10]。随着研究的进一步深入,人们发现化疗药物引起肿瘤的耐药性与耐药基因的表达和肿瘤干细胞启动肿瘤形成、生长有密切关系[11]。如何减少恶性睾丸生殖细胞瘤的耐药性,提高化疗效果,成为临床值得研究的课题。尽管许多研究对恶性睾丸生殖细胞瘤细胞增殖周期分子调控机制和药物治疗等方面进行了细致的探讨[12,13],但肿瘤干性基因在NT2细胞中的具体表达状况与顺铂引起的耐药是否有关目前尚无相关报道。

为确定CSCs是否参与了人恶性睾丸生殖细胞瘤对CDDP的耐药过程,本研究以人恶性睾丸畸胎瘤细胞系NTERA-2（embryonal carcinoma cells,NT2）为研究对象,用20μmol/L顺铂诱导NT2细胞（12 h、24 h、48 h）,通过免疫荧光染色、real-time PCR和Western-blot方法检测睾丸畸胎瘤干细胞标志性基因Sox-2、Oct-4和Nanog的表达及变化规律,同时对肿瘤干细胞耐药分子靶标ABCG2进行real-time PCR检测,初步探讨顺铂对人恶性睾丸生殖细胞瘤NT2细胞的影响与其干细胞特性的关系,为解决临床生殖细胞瘤治疗过程中高转移率和高复发率等问题提供一定的理论基础。

1 材料及方法

1.1 主要试剂及细胞来源

NT2细胞由湖南师范大学生命科学学院周畅老师惠赠。顺铂购自山东齐鲁制药有限公司。Sox-2、Oct-4和Nanog抗体购自长沙赛晶生物技术有限公司,β-actin兔抗购于美国Protein technology公司,标记的山羊抗兔和抗鼠IgG荧光二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。Total RNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Total RNA Kit域购于美国Omega公司,反转录试剂盒购于美国Invitrogen公司,目的基因和内参基因引物购于湖南擎科生物技术有限公司。BCA蛋白质浓度测定试剂盒和SDSPAGE凝胶配置试剂盒购于美国Biotime公司,RIPA裂解液、增强型ECL化学发光检测试剂盒购于长沙维世尔生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

以DMEM（美国Gibco公司）为基础培养基,同时加胎牛血清（fatal bovine serum,FBS,PAA公司）提供营养,具体的成分比例为90%DMEM+9%FBS+1%青链双抗。细胞传代时,NT2细胞均经过0.25%胰酶（trypsin-EDTA）消化2～3 min。培养条件为37℃、5%CO2,取对数生长期细胞用于实验。

1.3 相差显微镜观察

基于预实验的结果并参考文献[13],将顺铂处理NT2细胞的浓度确定为20μmol/L。顺铂配制:10 mL无菌PBS稀释顺铂（每支10 mg）后,一次性过滤器过滤除菌,然后用无菌PBS稀释成浓度为100μmol/L的母液。用CDDP分别培养12 h、24 h、48 h后在相差显微镜下观察NT2细胞形态变化并拍照。

1.4 免疫荧光染色法

将处于对数生长期的NT2细胞接种至3.5 cm的玻底培养皿中,每孔5×104个细胞,用20μmol/L的CDDP培养液继续培养48 h,随后4%多聚甲醛固定20 min,2%BSA封闭,0.3%Triton通透,Sox-2、Oct-4和Nanog一抗（1︰200）孵育过夜（4 ℃）,Sox-2和Nanog抗兔二抗（1︰500）以及Oct-4抗鼠二抗（1︰500）避光孵育1 h（37℃）,DAPI染核后防猝灭剂封片。激光共聚焦显微镜下观察各组细胞Sox-2、Oct-4和Nanog的表达量并对结果进行分析[14]。

1.5 RNA提取以及实时荧光定量PCR

将细胞制成细胞悬液,以1×106个细胞数接种于10 cm的细胞培养皿中,37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后更换培养液,选取20μmol/L的CDDP进行孵育处理,时间分别为12 h、24 h、48 h。按照试剂盒说明提取RNA,再反转录合成cDNA,反转录体系20μL,然后将反转录体系稀释10倍。RT-PCR反应体系为10μL,包括:2×PCR master mix 5μL;正反向引物工作液各0.5μL;cDNA模板1μL;无菌水3μL。每个样品设3个复孔。PCR反应条件:50℃2 min;95℃预变性10 min;95℃15 s,60℃1 min,40个循环。反应在ABI 7500实时荧光定量PCR系统进行。目的基因的定量表达通过与内参基因β-actin比较进行分析[15]。相关引物序列见表1。

1.6 Western-blot检测

将对数生长期的NT2细胞制成细胞悬液,以1×106细胞数接种于24孔的细胞培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后更换培养液,用20 μmol/L CDDP 分别培养 12 h、24 h、48 h后用RIPA细胞裂解液处理,12 000 r/min 4℃离心20 min,取上清,用BCA蛋白质定量试剂盒测定总蛋白质浓度,随后将蛋白质分装保存于-80℃冰箱。细胞裂解液经SDS-PAGE凝胶电泳后,用硝化纤维素膜电转系统转膜后进行免疫印迹,5%脱脂奶粉封闭2 h,4℃冰箱内孵育过夜。辣根过氧化酶标记的二抗孵育1 h后,用ECL超敏化学发光液显色曝光。使用Bio-Rad Quantity One软件对目的条带进行图像分析,测定灰度值,用β-actin作为内参来表示各组相对表达量且每组结果重复3次[16]。以上Western-blot各个步骤均按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒标准流程进行操作（蛋白质上样量均为50μg）。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0统计软件处理,用Adobe Illustrator Cs 5计算机软件制图。计量资料以均值±标准差（x±s）表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CDDP对NT2细胞形态的影响

倒置显微镜观察结果显示:对照组NT2细胞呈短梭形,细胞生长旺盛,细胞轮廓清晰且贴壁良好,呈汇合生长（图1A）,传代约1～2 d;20μmol/L CDDP 处理（12 h、24 h、48 h）后的 NT2 细胞随着处理时间增加,细胞变2,漂浮数量增多,活细胞数量明显减少,但仍有部分细胞可继续存活（图1B～D）。

2.2 免疫荧光技术检测Sox-2、Oct-4和Nanog在NT2细胞中的表达与定位

用免疫荧光法检测NT2细胞中肿瘤干细胞标记物Sox-2、Oct-4和Nanog的表达及定位,结果如图2所示。细胞核呈蓝色,Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白经抗体标记后呈绿色,各种蛋白质在NT2细胞上均有表达,其中Sox-2和Oct-4的荧光在NT2细胞中定位于细胞质（图2A,B）,Nanog的荧光在NT2细胞中定位于细胞质,仅有少部分定位于细胞核（图2C）。相对于对照组细胞,CDDP处理组中细胞的Sox-2和Oct-4表达均无明显差别（图2D,E）,而Nanog的表达荧光强度有明显增强（图 2F）。

图1 倒置显微镜观察CDDP对人恶性睾丸生殖细胞瘤NT2细胞形态的影响（×4,标尺:20μm）（A）NT2细胞正常培养状态;（B）CDDP处理12 h;（C）CD-DP处理24 h;（D）CDDP处理48 h。Fig.1 The effect of CDDP on the morphology of human malignant testicular teratoma（NT2）observed by inverted microscope（×4,scale bar:20 μm）（A）Normal condition of NT2 cells;（B）Treatment with CDDP for 12 h;（C）Treatment with CDDP for 24 h;（D）Treatment with CDDP for 48 h.

图2 免疫荧光观察CDDP孵育48 h NT2细胞中肿瘤干细胞标志物Sox-2、Oct-4和Nanog的定位表达Fig.2 Confocal microscope observation of location and expression of cancer stem cell markers Sox-2,Oct-4 and Nanog in NT2 cells incubated with CDDP for 48 h

2.3 CDDP对NT2细胞Sox-2、Oct-4和Nanog mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示,与Control组相比,CDDP处理组NT2细胞中Sox-2、Oct-4和NanogmRNA的表达量均显著增加（图3,P<0.05）。CDDP处理12 h、24 h、48 h的NT2细胞中Sox-2 mRNA 表达量分别为 7.07±1.33（t=0.006）、6.31±0.93（t=0.012 6）和 10.34±1.43（t=0.012 7）,Oct-4 mRNA 表达量分别为 10.81±0.25（t=0.000 8）、12.85±0.70（t=0.002 9）和 13.26±0.18（t=0.012 7）,NanogmRNA 表达量分别为 2.99±1.14（t=0.045 7）、6.25±0.81（t=0.014 3）和 5.56±0.85（t=0.007 9）。

图3 Real-time PCR检测CDDP在NT2细胞中对Sox-2、Oct-4和Nanog mRNA表达的影响Fig.3 Effect of CDDP on Sox-2,Oct-4 and Nanog mRNA expression in the NT2 cells detected by real-time PCR*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001,experimental group vs.control group;n=3.

2.4 Real-time PCR检测CDDP对NT2细胞ABCG2 mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示:CDDP处理12 h、24 h和 48 h的 NT2细胞中ABCG2 mRNA表达量分别为 2.67±0.51（t=0.022 01）、6.12±0.73（t=0.004 96）和 46.39±18.95（t=0.038 59）,显著高于对照组（P<0.05）,且表达量随CDDP处理时间延长而明显增加（图4）。

2.5 CDDP对NT2细胞中Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白表达的影响

为进一步确定NT2细胞中干性基因的表达,用蛋白质免疫印迹实验检测Sox-2、Oct-4和Nanog的表达量。结果显示:Control组中Sox-2、Oct-4和 Nanog的表达量分别为 0.078±0.010、0.127±0.017和 0.047±0.005,而在 CDDP 处理 12 h、24 h和48 h的NT2细胞中,Sox-2表达量分别为0.134±0.013、0.133±0.016 和 0.090±0.011;Oct-4表达量分别为 0.165±0.017、0.289±0.020 和0.167±0.013;Nanog 表达量分别为 0.084±0.002、0.131±0.006和0.063±0.005。与 Control组相比,Sox-2在CDDP处理12 h、24 h时有极显著差异（P<0.001）;Oct-4和Nanog在CDDP处理各时间点均有显著性差异（P<0.05）。由此得出NT2细胞在CDDP处理后Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白的表达水平显著增加。

3 讨论

目前,临床上治疗肿瘤以化疗为主,而化疗耐药是肿瘤干细胞的重要特性,也是导致化疗失败和患者术后肿瘤复发、转移的重要原因。现已研究表明,肿瘤干细胞中高表达ABCG2与肿瘤细胞的耐药性密切相关[9]。Sox-2、Oct-4和Nanog能使体细胞向类ESC（embryonic stem cell）方向转化,在CSCs的各个分化阶段这些干细胞因子均呈现高水平表达,在维持肿瘤干细胞的自我更新以及干细胞特性等方面发挥着重要作用,其表达水平被认为是干细胞多功能性的重要标志[17,18]。

Sox-2是SOX基因家族的重要组成成员之一。研究表明Sox-2作为一个关键的转录调控因子,与人体正常干细胞、肿瘤干细胞的自我更新及多潜能的维持密切相关[19～21]。近年来研究表明Sox-2的异常表达与人体内多种肿瘤如卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌等的发生、发展密切相关,并且Sox-2被认为是肿瘤干细胞的重要标志之一[22～24]。现有研究发现与铂类敏感的卵巢癌细胞株相比,Sox-2的表达在铂类耐药的细胞株中显著增加,而且免疫组织化学实验也验证了Sox-2蛋白在耐药细胞中的过表达,推测可能是存活下来的肿瘤干细胞高表达了Sox-2[22]。在胰腺癌的研究中人们同样发现,肿瘤干细胞往往伴有Sox-2的高表达[23]。大量研究结果显示,多种肿瘤的发生发展均与Sox-2的异常表达有关。本研究从形态学、mRNA水平及蛋白质水平对其进行鉴定,结果表明:与Control组相比,在CDDP处理后的NT2细胞中Sox-2的表达随处理时间的延长而显著增加,由此说明NT2细胞对CDDP的耐药性与Sox-2的干细胞特性密切相关。

Oct-4属于POU转录因子成员,是一种多能干细胞标记物,有研究认为Oct-4也与CSCs关系密切[25]。Oct-4基因的高表达在口腔鳞状细胞癌和胃癌顺铂的耐药中起着重要的作用[26,27]。本实验结果显示,经CDDP作用后的NT2细胞中Oct-4表达明显高于Control组,表明NT2细胞对CDDP的耐药性与Oct-4的干细胞特性密切相关。

Nanog是近年来新发现的一种重要的多能干细胞转录因子,其不仅在维持胚胎干细胞、肿瘤干细胞的干性和自我更新中起重要作用[28～30],而且在卵巢癌[31]、乳腺癌[32]、结肠癌[33]等多种肿瘤干细中高水平表达。相关研究表明Nanog的异常表达与肿瘤的发生、发展、耐药、转移和复发等密切相关。Zhang等[31]从卵巢癌组织中成功分离得到CSCs,这群细胞不仅高水平表达Nanog,并且对于化疗药物显示出较强耐药性。Huang等[32]从人乳腺癌细胞系中分离得到CSCs,结果显示Nanog基因在CSCs中高表达,对化疗药物的敏感性降低。本研究采用实时荧光定量PCR和Western-blot技术对Nanog的表达进行了检测。结果显示,在CDDP处理后的NT2细胞中Nanog的表达明显高于Control组（P<0.05）,提示Nanog可能通过维持肿瘤干细胞的干性促进肿瘤的发生发展。

图5 Western-blot检测CDDP在NT2细胞中对Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白表达的影响Fig.5 Effect of CDDP on Sox-2,Oct-4 and Nanog protein expressions in the NT2 cells detected by Western-blot*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001,experimental group vs.control group;n=3.

肿瘤干细胞是否存在耐药性已成为目前鉴定肿瘤干细胞的重要环节,这为耐药细胞可能更易富集干细胞这一观点提供了有力的证据。ABCG2是一种ABC转运蛋白,可外排多种化疗药物,在肿瘤组织和肿瘤干细胞中高表达,从而导致肿瘤对多种化疗药物不敏感,并可作为富集干细胞的一个标志,是目前研究常用的肿瘤干细胞耐药靶标[34]。本研究采用实时荧光定量PCR技术对ABCG2 mRNA的表达进行了检测,结果显示,与Control组比较,CDDP处理组NT2细胞中ABCG2 mRNA的表达显著增加,表明ABCG2高表达是人恶性睾丸生殖细胞瘤NT2细胞对CDDP产生耐药的机制之一。

在本研究中,经CDDP处理后的NT2存活细胞中Sox-2、Oct-4、Nanog肿瘤干细胞标记物的mRNA和蛋白质水平以及ABCG2 mRNA水平与人恶性睾丸生殖细胞瘤的化疗效果有关,其高水平表达或许是化疗效果差和耐药的主要原因之一,提示顺铂导致人恶性睾丸生殖细胞瘤的细胞耐药可能与肿瘤细胞的干细胞特性增强有关。

近年,随着对肿瘤干细胞标志物Sox-2、Oct-4、Nanog在多种恶性肿瘤组织和细胞中的功能研究逐渐深入,了解化疗药物处理后肿瘤干细胞相关表型和耐药相关机制,利用肿瘤干细胞的生物学特性进行靶向治疗已成为今后肿瘤研究中的重要方向。因此,探讨人恶性睾丸生殖细胞瘤的耐药机制,对临床生殖细胞瘤治疗过程中寻找逆转肿瘤干细胞耐药的有效治疗策略具有重要意义。