王 鸿，周广敏，华 熠

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014）

海洋微生物因处于独特的高压、高盐、低温等环境造就了其与陆地微生物不同的代谢途径[1]，海洋来源的放线菌产生了许多具有生物活性的次级代谢产物，包括抗菌、抗肿瘤、细胞毒性、免疫抑制剂等，生长在未知或未开发环境中的放线菌，包括研究较少的海洋环境中的放线菌，成为开发新次级代谢产物的主要来源[2]。

本文针对一株分离自西南印度洋2945 m深的海洋沉积物中的稀有放线菌新菌株Amycolatopsis sp.WP1，进行发酵，以抗菌活性追踪为导向，对其次级代谢产物进行了研究。

1 实验部分

1.1 实验仪器与材料

Amycolatapsis sp.WP1是采自西南印度洋深海洋沉积物中的稀有放线菌新菌株，由国家海洋局第三研究所张改云老师鉴定[3]，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCCNo.10738。

金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus AB 2010021）、大肠杆菌（Escherichia coli AB 94012）、白色念珠菌（Candida albicans AY 204006）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis CMCC（B）63501）为浙江工业大学药学院保存。

1.2 实验方法

1.2.1 实验培养基

ISP2海水液体培养基（g/L）：酵母提取物4 g；麦芽提取物 10 g；葡萄糖4 g；海盐 33 g；pH＝7.3，121 ℃，1×105Pa灭菌 20 min待用。

ISP2海水固体培养基（g/L）：酵母提取物4 g；麦芽提取物10 g；葡萄糖4 g；海盐 33 g；琼脂 15 g；pH＝7.3，121 ℃，1×105Pa灭菌 20 min 待用。

AM2 海水液体培养基（g/L）：大豆粉 10 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，可溶性淀粉5 g，酵母提取物 2 g，K2HPO40.5 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，pH＝7.4，121 ℃，1×105Pa灭菌 20 min待用。

1.2.2 菌株的发酵、萃取

菌株在ISP2海水固体培养基活化后，挑取适量的单菌落接种到ISP2海水液体培养基中，于30℃，180 r/min下振荡培养3 d，该菌液作为发酵的种子液。

按照10%的接种量，将种子液接种到含有AM2海水液体培养基中，于30℃，180 r/min下振荡培养5 d。发酵液在8000 r/min、4℃条件下离心10 min，取上清液，用等体积乙酸乙酯萃取二次后，乙酸乙酯层浓缩至干，称重。

1.2.3 粗提取物的分离纯化、结构鉴定

利用小孔树脂MCI对粗提取物进行初步分离，以纯水、纯水-甲醇（4 ∶1）、纯水-甲醇（3 ∶2）、纯水-甲醇（2 ∶3）、纯水-甲醇（1 ∶4）、纯甲醇各 2个柱体积依次洗脱，收集各个梯度洗脱液。将洗脱液旋蒸、浓缩，纯水段舍弃，获得5个分段，分别为 A、C、B、D、E段。用 DMSO将分段溶解成50 mg/mL的样品，备用。选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌，革兰氏阴性菌大肠杆菌，真菌白色念珠菌作为指示菌株，采用杯碟法检测各个分段的抑菌活性[4]。

对5段进行HPLC分离纯化，在分析型色谱柱 Phenomenex（USA，Luna 5u C18）进行条件摸索，后用半制备型色谱柱（Agilent XDB C18）进行分离，最后用分析型色谱柱纯化得到单体化合物，通过NMR分析，文献对比，确定化合物结构。

1.2.4 单体化合物的体外抗菌MIC评价

DMSO溶解单体化合物使浓度为5 mg/mL，备用。使用微量稀释法对单体化合物进行体外抗菌MIC评价[5]。将待测样品加至96孔板中，利用新鲜培养基等倍稀释成以下浓度梯度：100μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.5625 μg/mL、0.7825 μg/mL， 并加入指示菌菌悬液至100 mL。等体积的DMSO作阴性对照，等体积的氨苄青霉素钠或两性霉素B作阳性对照。细菌在37℃下培养24 h，真菌在28℃下培养48 h后，观察实验结果，以肉眼判断无菌生长的最低浓度为MIC（μg/mL）。

2 实验结果与讨论

Amycolatapsis sp.WP1菌株共发酵培养100 L，获得粗提取物23.5 g。

2.1 粗提取物各分段的抗菌活性

抑菌实验效果结果如图1所示，D段对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用，A、C、E段只对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，5段对白色念珠菌均没有抑制作用。

图1 各段的抗菌结果

2.2 单体化合物的分离、结构鉴定

根据各段的不同，采用不同的分离条件，分离得到7个化合物，经过NMR分析和文献对比，确定化合物的结构。

图2 化合物的结构

化合物1：淡黄色晶体，可溶于甲醇，分子式C16H12O5，分子量 284。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.85 （3H， s）， 6.40 （1H， d， J=1.7）， 6.64（1H， d， J=1.65）， 6.82 （2H， d， J=1.65）， 7.37（2H，d，J=7.1），8.39 （1H， s），9.70 （1H，s），12.95 （1H， s）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6）：56.22， 92.53， 98.18， 105.54， 115.23， 121.16，122.65，130.29，154.50，157.58，157.65，161.85，165.37， 180.56。 与文献[6]对比，确定为樱黄素（4'，5-diidroxi-7-metoxiisoflavona）。

化合物2：淡黄色晶体，可溶于甲醇、乙腈，分子式 C13H14O5，分子量 250。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：2.35 （3H， s）， 3.40 （3H， s）， 3.90 （3H，s）， 4.55 （2H， s）， 6.04 （1H， s）， 6.37 （1H， s），13.02 （1H， s）；13C-NMR（125MHz，CDCl3）：20.63，56.35， 58.39， 61.77， 89.79， 105.26， 109.08，109.28，158.37， 160.74，164.39，166.82，182.63。与文献[7]对比，确定为6-甲氧基甲基丁香酚（6-methoxymethyleugenin）。

化合物3：淡黄色晶体，可溶于甲醇，分子式C15H10O4，分子量254。淡黄色晶体，可溶于甲醇，分子式C15H10O5，分子量270。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6）：6.80 （2H， d， J=8.6）， 6.86 （1H， d，J=2.25）， 6.93 （1H， dd， J=2.2， 8.7）， 7.37（2H， d， J=8.8）， 7.96 （1H， d， J=8.8）， 8.29（1H， s）， 9.53 （1H， s），10.76 （1H， s）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：102.09， 114.94， 115.13，116.62， 122.53， 123.47， 127.30， 130.08， 152.84，157.17，157.43，165.52， 174.69。与文献[8]对比，确定为 4'， 7-二羟基异黄酮 （Daidzein， 4'， 7-Dihydroxyisoflavone）。

化合物4：淡黄色晶体，可溶于甲醇，分子式C15H10O5，分子量270。淡黄色晶体，可溶于甲醇，分子式C15H10O5， 分子量270。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6）：6.23 （1H， d， J=2.1）， 6.39 （1H， d，J=2.1）， 6.82 （2H， d， J=8.65）， 7.37 （2H， d，J=8.65）， 8.33， （1H， s）， 9.61 （1H，s），10.87（1H， bs）， 12.96 （1H， s）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6）：93.64，98.95，104.44，115.03，121.18，122.26， 130.13， 153.96， 157.39， 158.58， 161.98，164.27，180.19。 与文献[9]对比，确定为 4'，5，7-三羟 基 异 黄 酮 （Genistein， 4'，5，7-trihydroxyisoflavone）。

化合物5：白色针晶，可溶于甲醇，分子式C21H20O9，分子量 416。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.16-3.72 （6H，m）， 5.08 （1H，m）， 6.81（2H， d， J=8.6）， 7.14 （1H， dd， J=2.25， 8.85），7.23 （1H， d， J=2.25）， 7.41 （2H， d， J=8.55），8.04 （1H， d， J=8.9）， 8.39 （1H， s）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：60.63， 69.62， 73.12，76.47， 77.21， 99.97， 103.37， 114.97， 115.58，118.46， 122.30， 123.69， 126.95， 130.08， 153.69，157.03，157.26，161.39， 178.74。与文献[9]对比，确定为大豆苷，即4’，7-二羟基异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖 （4'，7-hydroxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物6：白色针晶，可溶于甲醇，分子式C23H22O10，分子量 458。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.74-4.45 （6H， m），5.16 （1H，d，J=7.35），6.82 （2H，d，J=8.6），7.13 （1H，dd，J=2.35，8.9），7.22 （1H，d，J=2.3），7.40 （2H，d，J=8.65）， 8.05 （1H， d， J=8.9）， 8.39 （1H， s）；13CNMR（125 MHz，DMSO-d6）：20.67， 63.09， 69.80，73.06， 73.81， 76.26， 99.65， 103.48， 115.02，115.49， 118.55， 122.27， 123.76， 127.00， 130.10，153.42， 157.02， 157.33， 161.15， 170.27， 174.79。与文献[10]对比，确定为 6″-乙酰基-大豆苷（6″-O-acetylgenistin）。

化合物7：白色针晶，可溶于甲醇，分子式C22H22O10，分子量 446。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.88 （3H，s），4.61 （1H， t）， 5.15 （1H， d，J=4.95）， 5.43 （1H， d， J=2.7）， 5.17 （2H， d， J=7.15）， 5.43 （1H， d， J=2.7）， 6.81 （2H， d， J=8.6）， 7.32 （1H， s），7.40 （2H，d， J=8.6），7.48 （1H， s），8.38 （1H，s）， 9.57 （1H，s）；13CNMR（125 MHz，DMSO-d6）：55.83， 60.62， 69.57，73.02， 76.76， 77.21， 99.61， 103.42， 104.72，114.99， 117.81， 122.59， 123.13， 130.08， 131.54，147.46，151.54，153.06，157.21， 174.39。 与文献[11]对比，确定为黄豆黄苷（Glycitin）。

2.3 单体化合物的MIC

选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、枯草芽胞杆菌作为指示菌株，采用微量稀释法对化合物进行体外抗菌活性MIC评价。实验结果显示，7个化合物对四株指示菌都没有较好的活性（MIC＞100 μg/mL）

2.4 讨论

粗提取物具有抗菌活性，但最终没有分离得到具有抗菌活性的化合物，分析原因：分离过程中，多使用紫外检测器对化合物进行分离，有些具有活性的化合物没有较好的紫外吸收，或所选用的波长不是该活性化合物最大吸收波长，因而在纯化过程总可能被忽略舍弃；粗提物和各段中的多种化合物之间产生的抑菌作用协同、相加，表现出明显的透明圈，而单个化合物可能产生的抑菌效果较弱；由于分离手段和分离经验不足，使得具有良好抑菌效果的化合物没有分离到。

3 结论

对一株深海来源的放线菌进行发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取，得到粗提取物，以抗菌活性追踪为导向，将粗提取物初步分离为5段，并对这5段进行抗菌实验，其中有4段对金黄色葡萄球菌都有较好的抑菌活性，有1段对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌都有很好的抑菌作用。进一步的分离，得到7个已知化合物，分别是樱黄素（1），6-甲氧基甲基丁香酚（2），4'， 7-二羟基异黄酮（3），4'，5，7-三羟基异黄酮（4），大豆苷（5），6″-乙酰基-大豆苷（6），黄豆黄苷（7），这 7个化合物均是首次在这株菌中分离得到。对这7个化合物做了抗菌活性评价，MIC结果显示，7个化合物都没有较好的抗菌活性 （MIC＞100μg/mL）。虽然这些化合物没有显示出较好的抗菌活性，但是生物活性导向仍然是活性化合物分离的重要方式。如何有效快速地分离得到具有生物活性的化合物，是微生物次级代谢产物的重点和难点，加强海洋来源微生物的研究依然是重要和有意义的。