郭 娟，邱 帅，刘华红，魏建芬，陈徐平，陈林敬，卢 山

(1.杭州市园林绿化股份有限公司，浙江 杭州 310020；2.浙江理工大学 建筑工程学院，浙江 杭州 310018)

冬青属(Ilex)为冬青科(Aquifoliaceae)一大属，树形整齐、树冠优美，果实通常红色光亮，经冬不落，分外艳丽，极具观赏价值，全世界400多种，我国200多种[1]。目前，对冬青属植物的报道主要集中在冬青的分类[2-3]、繁育[4-5]、园艺应用[3-4,6]及遗传多样性[7]等方面的研究。在欧美国家，杂交冬青已成为园林绿化中十分重要的观赏树种，而我国对冬青属植物杂交育种尚未有报道。因此，通过杂交育种的方法培育冬青新品种意义重大。冬青属不同植物花期相差较远，最多可达数月，经过长期贮藏后，花粉能否保持较高生活力是冬青杂交成败的关键。除了不同种之间的遗传差异外，贮藏条件是影响花粉生活力的重要因素，其中温度和湿度尤为重要[8]。研究表明[8-10]，低温低湿条件下，多数植物的花粉都能贮藏较长时间并保持生活力，但少见冬青属植物相关研究。花粉生活力主要体现在花粉萌发率和花粉管长度两个方面[11]。离体培养提供的花粉萌发条件与花粉在柱头上的萌发条件较为接近，且数据可靠亦可定量是目前花粉生活力测定的首选方法[12-13]。离体培养在杏[14]、山玉兰[12]、红山茶[15]、石榴[16]等植物研究中都有应用，但不同植物的花粉萌发培养基组分存在较大差异。

本研究通过对4种冬青属植物进行以蔗糖、H3BO3、Ca2+为变量设计的正交试验L25(53)研究，探讨4种冬青属植物花粉体外萌发的最适液体培养基，并对花粉体外萌发动态进行细胞学观测；研究不同贮藏条件对花粉萌发率及花粉管生长的影响，为冬青杂交育种提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料于2017年3-4月采自杭州植物园、杭州市园林绿化股份有限公司青山基地和径山基地，采集生长健壮的冬青属4个种的成年植株 (表1)。采集大蕾期的花枝，带回实验室水培，选择含苞待放的花蕾，剪去花被片，将花药散落在硫酸纸上，放入硅胶干燥器中充分干燥，待花粉完全散出后及时收集到2 mL离心管中用于花粉培养基选择及花粉贮藏试验。冬青属各品种开花期不一致，试验依据开花时间依次进行，处理方法一致。

表1 4种冬青属植物花粉的采集

1.2 试验方法

1.2.1 花粉离体萌发法 采用液体培养法，以蔗糖(0%、5%、10%、15%、20%)、H3BO3(0.000%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%)、CaCl2(0.000%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%)进行3因素5水平共25个组合L25(53)的正交试验，以萌发率和花粉管长度为指标，以短梗冬青为材料进行初步筛选，其余3个品种从较优组合中再筛选出各自的最佳培养基组合。参考张超仪[17]的方法，在双孔凹型载玻片孔内各滴入1滴培养液，用毛笔将花粉均匀点入培养液中，将载玻片放入保湿的培养皿内，置于25℃人工气候箱中暗培养4 h。在40×显微镜下观察统计，花粉管长度超过花粉粒直径即视为已萌发，每处理统计至少10个视野，每个视野花粉不少于50粒。计算公式：萌发率=萌发花粉数/花粉总数×100%。使用Motic BA 400生物显微镜数码显微图像系统随机对花粉管进行长度测量，每处理随机选择10根花粉管测量。花粉管长度计数单位为1 D=1倍的花粉粒直径。

1.2.2 花粉的贮藏 以上述干燥的花粉作为试验材料，每2 g分装于2 mL离心管内密封保存，并置于4℃、-20℃ 2种不同条件下贮藏。每隔0、2、7、14、21、28、35、42、49、56 d和180 d取出一部分花粉，使用筛选的最优培养基进行培养，观测是否有萌发率。试验操作步骤、培养条件及统计方法同上述离体培养法。

1.3 数据统计与分析

统计每个视野冬青花粉萌发率、花粉管长度，用Excel 2007软件进行数据处理和图表制作，用SPSS 19.0软件进行方差分析，使用R语言corrplot包进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 蔗糖、H3BO3和CaCl2对冬青花粉萌发的影响

短梗冬青花粉萌发正交试验均值(表2)表明，不同浓度的蔗糖、H3BO3和CaCl2对花粉萌发率的影响存在差异(P<0.05)。随着蔗糖浓度的增加，花粉萌发率呈现先升后降的趋势。蔗糖浓度为0%时，花粉萌发率最低，蔗糖浓度处于5%～10%时，萌发率逐渐升高，当蔗糖浓度为10%时，花粉萌发率达到最大值，均值7.88%，蔗糖浓度在10%～20%时，花粉萌发率随蔗糖浓度升高而迅速降低，其中蔗糖浓度20%时，部分花粉发生质壁分离，萌发率均值为2.55%，表明高浓度蔗糖对花粉萌发有一定的抑制作用，有效促进花粉萌发的蔗糖浓度为5%～10%。随着H3BO3浓度的增加，花粉萌发率呈现先升后降的趋势。H3BO3浓度在0.000%～0.002%，短梗冬青花粉萌发率随着浓度升高而迅速上升，H3BO3浓度为0.002%时萌发率达到最大值，萌发率平均8.77%，H3BO3浓度>0.002%时，花粉萌发率下降，在0.004%～0.008%，萌发率无显著差异，表明低浓度的H3BO3对花粉萌发率的促进作用显著高于高浓度，适宜的H3BO3浓度为0.002%。随着CaCl2浓度的增加，花粉萌发率呈现下降趋势。CaCl2浓度为0%时，花粉萌发率最高，平均值为9.08%，当CaCl2浓度>0%时，花粉萌发率迅速下降，CaCl2浓度在0.005%～0.020%，花粉萌发率无显著差异，表明CaCl2的加入会抑制短梗冬青花粉的萌发率。

短梗冬青花粉萌发正交试验均值(表2)表明，不同浓度的蔗糖、H3BO3和CaCl2对花粉管长度生长的影响存在差异(P<0.05)。随着蔗糖浓度的增加，花粉管长度整体表现为增加趋势，但差异不显著，其中蔗糖浓度20%时，花粉管长度达到最大值，均值5.27 D。随着H3BO3浓度增加，花粉管长度呈现先增后减的趋势，H3BO3浓度在0.000%～0.004%时，花粉管长度迅速增加，H3BO3浓度为0.004%时，花粉管长度达到最大值，均值为5.89 D，H3BO3浓度在0.004%～0.008%时，花粉管长度逐渐减短，但仍然高于对照值(H3BO3浓度为0.000%)，表明H3BO3促进花粉管生长，低浓度的促进作用高于高浓度。随着CaCl2浓度的增加，短梗冬青花粉管表现为先减后增，CaCl2浓度为0.00%时，花粉管长度达到最大值，均值为5.17 D，CaCl2浓度为0.000%～0.010%时，花粉管长度逐渐减短，0.010%时花粉管长度最短，均值为3.55 D，当CaCl2浓度为0.010%～0.020%时花粉管长度逐渐增加，0.020%时花粉管长度为4.23D，CaCl2浓度为0.005%～0.020%时花粉管长度无显著差异，表明CaCl2的加入对短梗冬青花粉管生长有一定的抑制作用。

表2 不同因素水平对短梗冬青花粉萌发率和花粉管长度的影响

注：表中数据为平均值±标准误，同列相同小写字母表示0.05水平差异不显著。下同。

2.2 花粉最适培养基筛选

短梗冬青花粉正交试验均值(表2)表明，蔗糖浓度处于5%～10%，硼酸浓度处于0.002%～0.006%，CaCl2为0.000%时，花粉萌发率与花粉管长度生长均处于较高水平。正交试验方差分析表明(表3)， 蔗糖浓度处于5%～15%，均有花粉萌发率与花粉管长度值显著高于同浓度的其他处理，花粉管长度在蔗糖浓度20%时取的最大值，但由于蔗糖浓度较高，导致部分花粉质壁分离，所以该浓度并不是花粉萌发的适宜浓度。因此，结合花粉萌发率和花粉管长度值，选出萌发率值较高，花粉管长度较长，表现出较高活力的6个处理，分别为处理8、处理9、处理12、处理14、处理17和处理20作为其余3种冬青属植物花粉萌发的液体培养基进行筛选。以上试验结果表明：由正交试验均值选出的蔗糖、H3BO3和CaCl2各自的较优水平组合的培养基，与正交设计方差分析结果选出的较优处理并不完全一致，这可能与正交试验中不同因素组合对花粉萌发率与花粉管长度生长的影响有别于单因素影响有关。正交试验均值的影响表现为，在正交表中蔗糖、H3BO3和CaCl2的任一水平下都均衡地包含着另外2个因素的5个水平，当比较某因素不同水平时，其它因素的效应均可彼此抵消，因此，不同因素的各水平差异均由该因素引起。

3种冬青方差分析结果(表4)表明：全缘冬青花粉在处理12中萌发率最高，且花粉管长度生长良好，显著高于其余的4个组合；大叶冬青花粉在处理14中萌发率及花粉管长度都显著高于其他组合；大别山冬青花粉在处理9中萌发率及花粉管长度都显著高于其他组合。综合得出：短梗冬青、全缘冬青花粉最适培养基为处理12、大叶冬青为处理14、大别山冬青为处理9。

表3 短梗冬青花粉在正交试验中的萌发率和花粉管长度

表4 3种冬青花粉最适培养基的筛选

2.3 不同贮藏条件对冬青花粉生活力影响

2.3.1 不同贮藏条件对冬青花粉萌发率的影响 由图1A可知，总体上，在4℃和-20℃贮藏条件下，冬青花粉萌发率随时间的增加表现为先降后升再降的趋势，相同培养时间，在2种贮藏条件下的花粉萌发率无显著差异，但-20℃最大值较4℃高，随着时间增加花粉萌发率下降趋势较4℃缓慢。由图1a可知，在2种条件下，短梗冬青花粉贮藏2 d，花粉萌发率显著降低，贮藏2～14 d期间萌发率也有小幅度下降，贮藏14～28 d花粉萌发率显著升高，其中在-20℃条件下，贮藏28 d时萌发率达到最大值72.74%，显著高于4℃条件，随后下降，180 d花粉萌发率降至14.23%，在4℃条件下，花粉萌发率持续上升，贮藏42 d时花粉萌发率达到最高56.88%，随后下降，180 d萌发率降至4.07%，表明短梗冬青更适合在-20℃条件下贮藏。由图1b可知，全缘冬青花粉在2种贮藏条件下先增后减的趋势是一致的，但萌发率最大值4℃条件下显著高于-20℃，在花粉贮藏7～28 d期间萌发率均表现为4℃条件下显著高于-20℃条件，在贮藏35～180 d期间2种条件下萌发率无显著差异，49 d除外，4℃条件下花粉贮藏7 d萌发率达到最大值21.66%，在-20℃条件下，贮藏14 d时达到最大值15.24%，随后呈现下降趋势，56 d花粉萌发率都降至4%以下，结果表明4℃更适合全缘冬青花粉的短期贮藏。由图1c可知，大叶冬青花粉萌发率在2种贮藏条件下贮藏7～42 d期间均表现为缓慢上升，4℃条件下贮藏7～42 d期间的花粉萌发率均显著高于-20℃条件下的花粉萌发率，贮藏42 d时萌发率均达到最高，4℃条件下贮藏的花粉萌发率为14.66%，-20℃条件下为10.23%，随后4℃条件下贮藏的花粉萌发率迅速下降，56 d降至3.53%，180 d活力为0，-20℃条件贮藏的花粉活力下降较缓慢，180 d花粉仍有一定活力，萌发率为2.30%，结果表明，4℃适合大叶冬青花粉短期内保存，-20℃则适合较长时间的花粉活力保存。由图1 d可知，大别山冬青花粉在2种贮藏条件下，贮藏2 d时萌发率均达到最高，4℃条件下贮藏的花粉萌发率为10.01%，-20℃条件下贮藏的花粉萌发率为10.95%，随后花粉活力迅速下降，贮藏7 d时均已降至5%以下，表明大别山冬青花粉活力下降速度较快，2种贮藏条件下花粉萌发率无显著差异。

2.3.2 不同贮藏条件对冬青花粉管生长的影响 由图2A可知，总体上，在4℃和-20℃贮藏条件下，4种冬青花粉管长度随着贮藏时间增加都表现为先增后减，4℃条件下花粉管长度最大值显著高于-20℃，但-20℃条件下随着时间增加花粉管长度减短趋势较4℃缓慢。由图2a可知，短梗冬青花粉在4℃条件下贮藏0～42d期间花粉管长度先增后降，35 d达到最大值15.77 D，42～56 d期间长度维持在12～13 D，差异不显著，180 d花粉管长度仅有2.41 D；在-20℃条件下，贮藏7～56 d期间花粉管长度维持在10.82～12.81 D，差异不显著，由此看出，-20℃贮藏条件下的短梗冬青花粉管在较长一段时间内生长保持一致。由图2b可知，全缘冬青花粉在2种贮藏条件下，花粉管长度变化趋势较为一致，在4℃条件下，贮藏21 d时花粉管长度达到最大值12.51 D，在-20℃条件下，贮藏2 d时花粉管长度达到最大值14.27 D，随后均呈现下降趋势，-20℃条件下随着贮藏时间的延长花粉管长度减短趋势较4℃条件下缓慢，21～56 d花粉管长度显著高于4℃条件。由图2c可知，大叶冬青花粉在2种贮藏条件下，花粉管长度变化趋势较一致，均表现为先增后减，在贮藏0～49 d期间花粉管长度均高于10 D，4℃条件下，贮藏21 d时花粉管长度达到最大值22.44 D，-20℃条件下，贮藏14 d时花粉管长度达到最大值22.96 D，随后下降，贮藏56 d时，花粉管长度均降至10 D以下，表明在2种贮藏条件下，大叶冬青花粉均可保持较高的活力。由图2d可知，大别山冬青新鲜花粉的花粉管长度达到最大值，13.94 D，随后下降，贮藏0～7 d时花粉管长度在2种条件下表现一致，贮藏14～49 d期间，-20℃贮藏条件下花粉管长度减短趋势较4℃条件缓慢，贮藏21～28 d期间花粉管长度显著高于4℃条件，35 d后花粉管长度都降至3 D以下，表明大别山冬青花粉活力下降较快。

注：图A表示4种冬青花粉萌发率在4℃和-20℃ 2种贮藏条件下总体表现；图a～图d分别表示短梗冬青、全缘冬青、大叶冬青和大别山冬青花粉萌发率在4℃和-20℃贮藏条件下的变化。误差线为95%置信区间，相互重叠表示无显著差异，反之则差异显著。

图12种贮藏条件对4种冬青花粉萌发率的影响

Fig.1 Effect of 2 storage temperatures on pollen germination rate of 4Ilexspecies

注:图A表示4种冬青花粉管长度在4℃和-20℃2种贮藏条件下总体表现；图a～图d分别表示短梗冬青、全缘冬青、大叶冬青和大别山冬青花粉管长度在4℃和-20℃贮藏条件下的变化。误差线为95%置信区间，相互重叠表示无显著差异，反之则差异显著。

图22种贮藏条件对4种冬青花粉管生长的影响

Fig.2 Effect of 2 storage temperatures on pollen tube growth of 4Ilexspecies

2.4 花粉萌发率与花粉管生长动态相关性分析

对4种冬青花粉萌发率与花粉管长度进行相关性分析，由图3可以看出，总体上，4种冬青花粉萌发率与花粉管长度为弱正相关性，但不同贮藏温度下，不同冬青的两者相关性有较大差异。其中，大别山冬青在4℃和-20℃条件下花粉萌发率与花粉管长度均为强正相关，表明花粉管长度的增减趋势与花粉萌发率变化一致；大叶冬青的花粉萌发率与花粉管长度总体为正相关，但在4℃条件下相关性较强，-20℃为弱相关，4℃条件下萌发率高且花粉管长度长，-20℃条件下，花粉管最大值较萌发率最大值提前，表明大叶冬青在贮藏前期4℃条件下的花粉生活力更高；短梗冬青花粉在4℃和-20℃ 2种条件下萌发率与花粉管长度为正相关，相关性强弱差异不大，但在4℃条件下，花粉管的长度增减幅度较-20℃明显，-20℃萌发率高，且花粉管长度保持一致，表明在4℃条件下对花粉活力影响明显，20℃条件下，花粉活力保持更好；全缘冬青花粉总体上表现为二者弱相关性，其中在4℃条件相关性强于-20℃，相同时期，-20℃条件下，花粉萌发率较4℃低，但花粉管长度较4℃长，表明2种条件对全缘冬青花粉活力的影响有差异。

注：r介于-1和1，r=1，表示2个变量完全正相关，r=0时表示两变量非线性相关，r=-1时表示2个变量完全负相关。

3 结论与讨论

研究表明离体萌发法对所有花粉均适宜，大多数植物都采用离体萌发法来测定花粉活力与萌发特性[15]。花粉离体萌发受多种因素影响，其中蔗糖、硼酸和Ca2+是影响花粉萌发的重要因素。蔗糖为花粉萌发和花粉管形成提供必需的碳源和能量，调节花粉粒内外渗透压平衡[18]，不同种类的植物花粉萌发所需蔗糖浓度不同，同种植物不同品种间花粉适宜的蔗糖浓度亦存在差异[14]。本研究中，4种冬青属植物花粉萌发适宜的蔗糖浓度为5%～10%，其中短梗冬青、全缘冬青、大叶冬青适宜的蔗糖浓度为10%，大别山冬青为5%，浓度过低则萌发率较低，过高则抑制萌发甚至导致花粉细胞质壁分离，但蔗糖并非冬青花粉萌发的必要条件，在不添加蔗糖的溶液里仍有一定的萌发率，这与张超仪[17]对杜鹃花属植物的研究结果一致。硼酸影响花粉管的生长和形态，主要参与花粉管顶端细胞壁的构建[19]，影响花粉管的生长。通常花粉中的硼酸含量不足，需要柱头和花柱中的硼来补充，因此离体培养条件下均需添加一定量的硼酸来促进花粉萌发[11]。本研究中，低浓度的硼酸显著促进了短梗冬青(0.002%)、全缘冬青(0.002%)和大别山冬青(0.006%)，大叶冬青(0.006%)花粉萌发，硼酸浓度为0.000%时，花粉没有萌发，硼酸浓度较高时(0.008%)，促进作用减弱，这与山玉兰[12]、辽宁杨[13]花粉萌发所需低浓度的硼酸较为接近。另外，钙在花粉萌发和花粉管生长过程中也起一定作用，一定浓度的Ca2+是花粉萌发所必需的，外源Ca2+的需求取决于花粉细胞内游离钙的含量，内源钙充足时，Ca2+的添加可能造成细胞Ca2+中毒，产生过高的细胞膨压，从而抑制花粉的萌发及花粉管的生长[20-22]。外源钙可以替代花粉萌发时的群体效应[23]，促进花粉萌发。本研究结果显示，CaCl2的加入显著抑制了短梗、全缘、大别山冬青花粉的萌发和花粉管的生长，但对大叶冬青有促进作用，表明前者细胞内Ca2+含量可能相对较高，而后者细胞内源Ca2+不足。这与张超仪[17]对杜鹃花属植物花粉萌发率的研究结果较为一致，CaCl2的加入抑制了部分杜鹃品种花粉的萌发。

由于遗传差异，不同植物新鲜花粉生活力不同，而合适的贮藏条件是花粉能否长期保持活力的关键因素。因此，明确贮藏条件对不同植物花粉生活力的影响对解决花期不遇的植物杂交有着重要的指导意义。一般花粉贮藏温度有常温、4、-20、-70、-80、-196℃[24-26]。由于无需特殊设备，易于实现，常温、4 ℃和-20℃是实际生产过程经常用到的。本试验结果表明： 4种冬青花粉生活力在-20℃较4℃条件下保存时间长，其中短梗冬青花粉在2种条件下贮藏180 d仍有一定的活力，-20℃条件下活力较高；全缘冬青、大叶冬青花粉在4℃可贮藏2个月左右，贮藏56 d萌发率都降至4%以下，-20℃条件下贮藏180 d时仍有一定的活力，分别为0.9%和2.3%；大别山冬青相比较其余3种冬青花粉保存时间较短，贮藏7 d时，花粉萌发率都降至5%以下。一般来说，花粉生活力会随着贮藏时间的延长而下降，而本试验表明，4种冬青花粉的萌发率在短时间贮藏后显著增加，这可能与采收的新鲜花粉干燥时未充分散粉，在贮藏的过程中除了花粉的代谢活动，还有花粉的散出，到一定时间，花粉量达到最大值，从而出现萌发率最大值的现象有关。这一现象在油茶[10]、紫薇[27]和板栗[28]中都有报道，其他原因仍需进一步研究。花粉萌发率达到峰值后，之后随着时间的延长，活力逐渐下降，其中-20℃下降的趋势较4℃缓慢，这可能与花粉在低温贮藏条件下可溶性糖类和有机酸类消耗较少，从而花粉生活力下降得较慢有关[29]。

萌发率和花粉管长度常用来鉴定花粉的生活力。本研究表明，短梗冬青、大叶冬青和大别山冬青在2种贮藏条件下，花粉管长度总体变化趋势与花粉萌发率较为一致，而全缘冬青花粉在-20℃条件下储藏，前期花粉萌发率较4℃低，但相同时间的花粉管长度高于4℃条件，且贮藏期间花粉管长度增减幅度较小，张绍铃[30]认为，与萌发率相比，花粉管长度更能展现生活力，并与受精密切相关。从冬青杂交试验来看，即使萌发率低于5%，而花粉管较长，依然有一定的结实率，在一定程度上证明了张绍铃的结论，但依然需要进一步明确花粉管长度与结实率的关系。

综上可得，短梗冬青和全缘冬青花粉离体培养最适培养基为10%蔗糖+0.002% H3BO3，大叶冬青花粉适宜的培养基为10%蔗糖+0.006% H3BO3+0.010% CaCl2，大别山冬青为5%蔗糖+0.006% H3BO3；不同冬青的花粉生活力存在显著差异，短梗冬青>全缘冬青>大叶冬青>大别山冬青；短时间低温贮藏能够有效提高冬青花粉生活力；短时间贮藏，-20℃和4℃条件下，冬青花粉生活力变化差异不显著，而长时间贮藏，-20℃条件下生活力高于4℃；2种贮藏条件下，短梗冬青花粉贮藏时间最长，180 d仍有较高生活力，全缘冬青和大叶冬青次之，大别山冬青花粉贮藏时间最短，7 d之后活力均降到5%以下；短梗冬青和全缘冬青花期较早，花粉贮藏时间较长，适合作为冬青属种间杂交的父本，而大叶冬青和大别山冬青花期较晚，花粉生活力丧失较快，适合作为母本。