吴燕丽 张海燕

（华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030）

急性胰腺炎（AP）是由于多种原因导致胰蛋白酶在胰腺内被激活，引起胰腺组织自体消化、坏死等的一种急性胰腺炎症反应。流行病学研究表明，约15%～20%AP 患者可进展为重症急性胰腺炎（SAP）［1］。 SAP具有疾病进展速度快、并发感染率高、致死率高等特征，严重者发生全身性炎症反应，累及肾脏、肺等重要器官，其中SAP导致的急性肾功能衰竭是危害患者生命安全的重要并发症之一［2］。因此，有效地预防肾功能损伤对改善SAP患者预后和生存率具有重要意义。研究显示，炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）等参与SAP疾病进展，调控炎症因子水平可能控制SAP 疾病进展［3］。 核因子-κB（NF-κB）通路是机体重要的信号通路之一，在炎症性疾病如脓毒血症中发挥作用，抑制NF-κB通路可有效缓解炎症反应［4］。丹参素是从植物丹参中提取的芳香酸类复合物，具有抗血栓、抗炎、抗氧化等功效，已有研究证明丹参对急性肾损伤具有保护作用，但其主要成分丹参素在SAP所致肾损伤中的作用尚不清楚［5］。本研究通过建立急性坏死性胰腺炎（ANP）大鼠模型，观察丹参素对ANP大鼠肾损伤的保护作用，并初步探究其作用机制，旨在探究丹参素治疗ASP疾病的潜在作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠，SPF级，60只，体质量170～190 g，购自上海邦耀公司，许可证号：SCXK（沪）-2014-0002。本研究实验动物均在本院实验动物中心进行常规饲养，自由饮水/食，术前12 h进行禁食处理、不禁水。本研究中所有实验均经动物实验伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 丹参素（纯度≥98%，批号：67920-52-9），购自成都瑞芬思生物科技公司；醋酸奥曲肽注射液（规格：0.1 mg，以奥曲肽计，批号：H20090291），购自江苏奥赛康药业公司；4%多聚甲醛、HE染色试剂盒、蛋白提取试剂盒，购自上海生工生物技术公司；戊巴比妥钠、BCA试剂盒、戊二醛，购自碧云天公司；大鼠TNF-α ELISA试剂盒、大鼠IL-6 ELISA试剂盒、大鼠IL-8 ELISA试剂盒，购自美国R&D Systems公司；兔源一抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH、羊抗兔二抗，购自美国abcam公司；DAB显色试剂盒，购自北京百奥莱生物公司；全自动生化检测仪（AU5800），购自美国 Beck C公司；光学显微镜（CX23），购自日本奥林巴斯公司；蛋白电泳仪、全能型蛋白转印系统，美国Bio-Rad公司；石蜡切片机（SDSGA9000）等，购自上海科汇生物公司等。

1.3 模型制备 参照文献中方法制备ANP模型大鼠［6］。手术开始前，给予各大鼠麻醉处理，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（40 mg/kg），切开大鼠腹部正中，暴露并分离出十二指肠，采用注射器刺开胰胆管与十二指肠膜乳头开口下缘，于硬膜外置入5 cm导管，缓慢推进后扎合切口；将输液转换器接于导管末端，以0.2 mL/min速度逆行泵入5%牛黄胆酸钠（0.1 mL/kg），持续10 min，移除扎合线，退出导管，迅速缝合手术切口，归位十二指肠，逐层缝合腹腔，消毒后送回动物中心。假手术组，不穿刺泵药，仅打开腹腔后缝合。本研究制备SNP模型过程中无大鼠死亡，共50只大鼠造模成功，术后进行常规饲养。

1.4 分组与给药 按照随机数表法将50只ANP大鼠随机分为ANP组，奥曲肽组，丹参素低、中、高剂量组，每组10只，另设假手术组10只。丹参素低、中、高剂量组于术前 7 d， 定时给予丹参素 5、10、20 mg/（kg·d）灌胃治疗；奥曲肽组于术前7 d，定时给予奥曲肽2.4 mg/（kg·d）灌胃治疗；假手术组及 ANP 组于术前7 d，定时给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.5 标本采集与检测 造模24 h后，给予麻醉各组大鼠，腹主动脉血采血5 mL，用于肾功能及炎症因子检测；立即取出大鼠胰脏、肾脏，洗净后分别对称切半，一半置于4%多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，用于后续实验；一半切碎后置于液氮中速冻，转入-80℃冰箱保存。1）肾功能检测。采用低温离心机以3000 r/min转速，将血液标本离心10 min，取部分上清液，采用全自动生化检测仪测定各组大鼠血清中血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）含量。 2）苏木素-伊红（HE）染色法观察胰腺组织及肾组织病变。对大鼠胰腺组织和肾组织石蜡切片脱蜡、水化后，采用HE染色试剂盒对各切片进行染色，中性胶封片，置于光学显微镜下，观察大鼠胰腺组织、肾组织形态并采用半定量病理评估法对大鼠胰腺组织和肾小管损伤程度进行评价。3）血清TNF-α、IL-6、IL-8水平测定。采用大鼠TNF-α ELISA试剂盒、大鼠IL-6 ELISA试剂盒、大鼠IL-8 ELISA试剂盒检测各大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平。4）蛋白印迹法检测NF-κB蛋白表达水平。制备大鼠肾组织匀浆液，采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分别提取细胞质及细胞核总蛋白，采用BCA试剂盒分别测定细胞质及细胞核蛋白总量。SDS-凝胶电泳分离蛋白，采用全能型蛋白转印系统将蛋白转印至PVDF膜；加入5%脱脂奶粉，封闭1 h；PBS冲洗后分别加入兔源一 抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH（1∶500）进行孵育，4 ℃过夜；加入羊抗兔二抗（1∶4000）孵育，室温 1 h。 经化学发光试剂作用后，采用Tanon软件检测、分析并拍摄图像。

1.6 统计学处理 应用SPSS24.0统计软件。计量数据以（±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹参素对ANP大鼠胰腺、肾组织结构的影响1）胰腺组织。假手术组大鼠胰腺细胞规则，排列紧密，呈现胰岛；ANP组大鼠胰腺组织现空泡样改变、炎性细胞浸润、不规则间隙及坏死组织；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠胰腺组织损伤明显改善，呈剂量依赖效应。见图1。2）肾脏组织。假手术组大鼠肾小管和肾小体结构清晰、肾间质无水肿、肾皮质组织结构完整；与假手术组比较，ANP组大鼠肾小管结构肿胀、肾小球萎缩、肾皮质出现细胞水肿、坏死、有炎性细胞、小管腔凝固坏死等病变；丹参素低、中、高剂量组大鼠肾皮质细胞损伤减轻，肾小球萎缩减轻等病理程度减轻。见图2。病理评分结果显示，与假手术组比较，ANP组大鼠胰腺组织、肾组织的评分显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠胰腺组织、肾组织评分明显下降（P＜0.05），呈剂量依赖效应。见表1。

图1 各组大鼠胰腺组织结构（HE染色，400倍）

图2 各组大鼠肾组织结构（HE染色，400倍）

2.2 丹参素对ANP大鼠肾功能的影响 见表2。与假手术组比较ANP组大鼠血清中BUN和Scr含量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠血清中BUN和Scr含量明显减少（P＜0.05），呈剂量依赖效应。

表1 各组ANP大鼠胰腺组织、肾组织病理评分比较（分，±s）

表1 各组ANP大鼠胰腺组织、肾组织病理评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与丹参素低剂量组比较，※P＜0.05；与丹参素中剂量组比较，◇P＜0.05。 下同

组 别 n 胰腺组织 肾组织假手术组 1 0 0.3 9±0.0 6 0.4 5±0.0 8 A N P 组 1 0 8.1 3±1.6 3* 4.9 9±0.9 8*奥曲肽组 1 0 3.2 4±0.6 4*# 2.8 9±0.5 6*#丹参素低剂量组 1 0 6.5 0±1.2 7*# 4.4 2±0.8 7*#丹参素中剂量组 1 0 4.1 7±0.8 4*#※ 3.6 8±0.7 4*#※丹参素高剂量组 1 0 2.6 8±0.5 2*#※◇ 2.7 5±0.5 5*#※◇

表2 各组ANP大鼠肾功能指标比较（±s）

表2 各组ANP大鼠肾功能指标比较（±s）

组 别 n B U N（m m o l/L） S c r（μ m o l/L）假手术组 1 0 8.1 4±1.6 1 2 7.3 7±5.4 6 A N P 组 1 0 3 7.5 4±7.4 9* 2 0 3.5 4±3 9.4 6*奥曲肽组 1 0 1 4.1 9±2.8 2*# 1 0 3.2 8±1 9.9 7*#丹参素低剂量组 1 0 3 1.0 5±6.1 9*# 1 8 6.5 3±3 5.3 6*#丹参素中剂量组 1 0 2 0.3 7±4.0 6*#※ 1 3 5.4 9±2 6.9 8*#※丹参素高剂量组 1 0 1 2.9 3±2.5 7*#※◇ 9 8.3 6±1 9.6 5*#※◇

2.3 丹参素对ANP大鼠炎症反应的影响 见表3。与假手术组比较，ANP组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠血清组织中TNF-α、IL-6、IL-8 水平显著降低（P＜ 0.05），呈剂量依赖效应。

表3 各组大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比较（pg/mL，±s）

组别 n T N F-α假手术组 1 0 1 5 3.1 7±2 6.7 8 A N P 组 1 0 3 0 2.9 3±5 9.7 2*奥曲肽组 1 0 1 8 4.9 6±3 1.0 5*#丹参素低剂量组 1 0 2 6 7.4 1±5 0.6 7*#丹参素中剂量组 1 0 2 0 1.6 7±3 8.5 4*#※丹参素高剂量组 1 0 1 7 6.7 1±3 4.4 3*#※◇I L-6 I L-8 1 1 1.3 2±2 1.9 7 1 0 3.7 6±2 0.4 5 3 2 1.6 3±6 2.3 1* 2 8 6.8 1±5 1.2 3*1 4 9.2 7±2 9.4 9*# 2 5 1.4 2±4 8.9 7*#2 7 3.9 8±5 3.2 5*# 1 6 7.6 5±3 1.2 8*#2 3 2.6 1±4 3.6 7*#※ 1 1 9.2 4±2 1.7 6*#※1 3 7.5 4±2 5.7 6*#※◇ 1 1 1.3 9±2.1 4*#※◇

2.4 丹参素对ANP大鼠肾组织细胞凋亡的影响 见图3、表4。与假手术组比较，ANP组大鼠肾组织细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠肾组织细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），呈剂量依赖效应。

2.5 丹参素对 ANP大鼠肾组织中 NF-κB、cleavedcaspase3蛋白表达的影响 见图4、表5。与假手术组比较，ANP组大鼠细胞质中cleaved-caspase3蛋白显著增多、NF-κB蛋白显著减少，细胞核中NF-κB蛋白明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠细胞质中cleaved-caspase3蛋白显著减少、NF-κB蛋白显著增多 （P＜0.05），细胞核 NF-κB 蛋白显著减少（P＜0.05），呈剂量依赖效应。

图3 各组ANP大鼠肾组织细胞凋亡情况（TUNEL染色，200倍）

表4 各组ANP大鼠肾组织凋亡细胞比例的比较（±s）

表4 各组ANP大鼠肾组织凋亡细胞比例的比较（±s）

组 别 n 凋亡细胞比例（%）假手术组 1 0 4.7 3±0.9 1 A N P 组 1 0 4 9.4 6±8.6 3*奥曲肽组 1 0 1 2.3 5±2.6 1*#丹参素低剂量组 1 0 3 8.0 8±6.5 7*#丹参素中剂量组 1 0 2 1.6 7±4.1 3*#※丹参素高剂量组 1 0 8.2 9±1.5 1*#※◇

图4 各组ANP大鼠肾组织NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表达

表5 各组ANP大鼠肾组织NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表达的比较（±s）

表5 各组ANP大鼠肾组织NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表达的比较（±s）

组别 n c l e a v e d-c a s p a s e 3/G A P D H假手术组 1 0 0.9 1±0.1 7 A N P 组 1 0 2.1 9±0.3 9*奥曲肽组 1 0 0.9 4±0.1 5#丹参素低剂量组 1 0 2.1 5±0.4 1*丹参素中剂量组 1 0 1.9 5±0.3 7*#※丹参素高剂量组 1 0 1.2 1±0.2 3*#※◇质 N F-κ B/H i s t o n e H 2 A 核 N F-κ B/G A P D H 1.1 2±0.2 1 0.2 1±0.0 4 0.4 9±0.0 8* 0.8 3±0.1 2*0.6 7±0.1 3*# 0.4 6±0.0 9*#0.5 3±0.1 1*# 0.7 2±0.1 3*#0.7 8±0.1 4*#※ 0.4 9±0.0 9*#※1.0 9±0.1 9*#※◇ 0.1 8±0.0 4*#※◇

3 讨 论

AP是一种较为常见的消化系统疾病，其中多数AP患者具有自限性，一般在3～5 d内恢复，预后效果好，但某些AP患者可能继发腹膜炎、全身性炎症反应、多脏器功能衰竭等并发症，肾脏是最易累及的器官之一［7］。本研究采用胰胆管逆行穿刺结合牛黄胆酸钠法复制ANP大鼠模型，HE染色结果显示，ANP组大鼠胰腺组织现空泡样改变、炎性细胞浸润及细胞等病变；肾皮质出现细胞坏死、产生炎性细胞、肾小管结构肿胀、小管腔凝固等病变，且ANP组大鼠血清中BUN和Scr含量明显增高，表明ANP可导致大鼠肾损伤，模型制备成功。

丹参素是来自药用植物丹参的主要水提取物之一，是复方丹参注射液等多种药物的主要功效成分［8］。研究表明，丹参川芎嗪注射液可通过降低血清TNF-α等炎症因子含量，改善急性颅脑损伤患者临床症状，缓解神经功能障碍［9］。陈芳等曾报道，丹参通脉方可通过降低IL-6等炎性因子的表达，抑制凋亡通路激活，从而减轻人血管内皮细胞内质网应激损伤［10］。以上研究提示，丹参类药物具有一定炎症抑制功效，可改善炎症反应异常所致疾病。但丹参素在ANP所致肾损伤的作用机制尚不清楚。本研究发现，丹参素可明显减轻ANP所致大鼠肾功能障碍，减轻胰腺和肾脏组织病理损伤程度，降低血清中BUN和Scr水平，提示丹参素对ANP大鼠肾损伤具有保护作用，但其作用机制并不清楚。

ASP患者血清炎症反应增强，严重者可引发全身性炎症反应，威胁肺脏、肾脏等组织器官正常功能，是ASP造成多器官组织损伤的主要原因之一［11］。白细胞介素是一种细胞因子，参与调节机体免疫反应和炎症反应等生理过程［12］。肿瘤坏死因子是一种具有较强免疫活性的细胞因子，主要由巨噬细胞、T淋巴细胞等产生，参与炎症反应等多种生理过程［12-13］。Chen等发现，白藜芦醇可通过降低血清和肾组织中炎症因子水平抑制脂多糖诱导的急性肾损伤所致细胞凋亡，改善肾功能［14］。 Latchoumycandane 等研究显示，抗炎药物牛磺酸处理可通过抑制大鼠肾脂质氧化、减轻炎性细胞浸润，改善酒精诱导的肾炎性损伤［15］。本研究发现，与假手术组比较，ANP组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平显著升高；与ANP组比较，丹参素低、中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平显著降低，表明丹参素预处理可降低ANP大鼠血清炎症因子水平，提示丹参素可能通过抑制机体炎症反应保护ANP所致大鼠肾损伤。

研究表明，炎症因子的大量产生不仅可以对组织细胞造成损伤，还能激活凋亡相关基因的表达及转录［16］。另外，TNF-α等炎症因子可通过一系列信号传导，促使NF-κB从其抑制蛋白中分离、释放，移位进入细胞核而激活，诱导caspase等凋亡蛋白发生水解活化，激活细胞凋亡，细胞凋亡的异常也是造成肾组织损伤的原因之一［17］。董永喜等发现，辛芍组方可抑制NF-κB通路的活化，抑制大鼠神经细胞凋亡，从而发挥神经保护作用［18］。本研究发现，与假手术组比较，ANP大鼠肾组织凋亡细胞比例明显升高，丹参素低、中、高剂量组可显著降低ANP大鼠肾组织凋亡细胞比例，提示丹参素可减轻ANP所致大鼠肾细胞凋亡。另有研究显示，TNF-α诱导NF-κB通路的激活，在顺铂所致肾小管上皮细胞凋亡中发挥重要作用［19］。Ozkok等研究表明，抑制NF-κB通路的激活可显著抑制肾小管细胞凋亡和坏死，改善顺铂所致肾功能损伤［20］。本研究发现，ANP大鼠肾组织细胞中NF-κB蛋白核移位程度明显增高、cleaved-caspase3蛋白显著增多；低、中、高剂量丹参素干预后，ANP大鼠肾组织细胞中NF-κB蛋白核移位程度显著降低、cleaved-caspase3蛋白显著减少，表明丹参素具有抑制NF-κB通路和caspase3蛋白激活的功效，提示丹参素可能通过抑制NF-κB通路的激活来保护ANP所致肾损伤。