王 锐，刘亚东，于时良，任 昌，安瑞华

(哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150001)

肾结石是泌尿外科常见疾病之一。结石形成后在局部反复刺激上皮细胞促进肾间质纤维化[1-2]。肾结石绝大多数为草酸钙(calcium oxalate，Ca Ox)结石，因此构建草酸钙肾结石模型对研究抗肾纤维化机制就更具有普遍意义[3]。高草酸尿是草酸钙肾结石的主要危险因素之一，可对肾小管上皮细胞产生损伤，促进结石的滞留和粘附[4-6]。

草酸结晶可通过激活转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)/Smads途径诱导肾小管上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，进而促进肾纤维化的发生[5]。MG132是一种醛基肽类泛素-蛋白酶体抑制剂，可抑制蛋白的泛素化活性，并能以剂量依赖方式抑制TGF -β1 诱导的肾间质成纤维细胞的增殖[5]。本文从细胞实验层面多个角度阐述MG132可抑制EMT的形成及减少细胞氧化应激损伤，进而抑制肾间质纤维化的发生。

1 材料与方法

1.1材料高糖改良Eagle培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)合成液体培养基(美国Hyclone公司)，MG132蛋白酶体抑制剂(美国Sigma公司)，兔抗人上皮钙黏蛋白(E-cadherin)单克隆抗体、兔抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人N-钙黏着蛋白(N-cadherin)单克隆抗体、兔抗人Smad7单克隆抗体、兔抗人TGFβ1单克隆抗体(美国Abcam公司)，小鼠抗人β-actin单克隆抗体(上海碧云天公司)，活性氧检测试剂盒2′-,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′-,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH -DA)(中国碧云天生物技术有限公司)。

1.2细胞培养犬远端肾小管上皮细胞马丁达比狗肾(madin-darby canine kidney，MDCK)由本实验室保存。将其培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2的温度培养箱中常规培养传代。待细胞生长至覆盖率为80%左右时予以药物草酸和MG132干预。研究共分为3组：正常对照组、草酸干预组(Oxalate组)、草酸+MG132干预组(Ox+MG132组)。

1.3Westernblot细胞模型构建完成后提取蛋白，采用蛋白定量试剂盒(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)配制后依次电泳、电转，用含5%的脱脂奶粉室温封闭1 h、孵育E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7抗体1 h，4 ℃冰箱过夜。次日以含吐温-20的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline with tween-20，PBST)洗涤后用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗孵育1 h，再次用PBST洗涤后将聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜放入Bio-Rad成像仪，选择合适的参数，滴加电化学发光(electro-chemi-luminescence，ECL)发光液后进行显影，对结果运用Image Lab软件分析处理。

1.4活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)检测细胞种植于6孔板中，待细胞生长覆盖率达到80%左右时，予以草酸和MG132干预2 h。诱导完毕后，胰酶消化细胞离壁至离心管中。离心后加入含DCFH-DA探针的无血清培养液将离心管中细胞重悬，于37 ℃培养箱中孵育20 min，期间每间隔3～5 min吹打混合一次。然后各组取相同数目的细胞重悬于500 uL的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中。再用200目滤网过滤转移至流式碧迪医疗(becton dickinson，BD)管中，适度摇匀后上机检测。结果用流式分析软件分析计算，所有实验操作均3次以上。

1.5细胞内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)水平的测定SOD对机体的氧化与抗氧化平衡有重要作用，其可以清除超氧阴离子自由基从而保护细胞免受损伤。由黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统所产生的超氧阴离子自由基可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，在550 nm处用酶标仪测其吸光度。计算公式为0.5×(对照吸光度A值-测定A值)/(对照A值)×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

2 结 果

2.1ROS发生率流式细胞仪检测发现(图1、图2)，草酸组较正常组ROS发生率增加4倍左右。而与草酸组相比，MG132组会降低草酸诱导所产生的ROS。

图1各组干预后ROS的发生率(%)

A:正常对照组；B：Oxalate组；C：Ox+MG132组。

图2 各组干预后活性氧表达量柱形图*与Oxalate组比较，P<0.01。

2.2EMT相关蛋白的表达各组蛋白表达具体结果见图3A,与正常组相比， Vimentin、N-cadherin表达升高，而MG132干预后上述蛋白的表达量会降低；而E-cadherin表达与间质蛋白表达量完全相反(图3B、C、E)。

2.3TGFβ1/Smads通路相关蛋白的表达TGFβ1蛋白在草酸干预后表达量增加，而MG132会减弱这种影响。而Smad7负反馈调节TGFβ1的表达，3组间该蛋白的表达量与TGFβ1相反(图3D、F)。

图3E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7蛋白的表达

A：E-cadherin、N-cadherin、TGFβ1、Vimentin、Smad7蛋白表达条带图；B：上皮钙黏蛋白表达水平柱状图；C:N -钙黏着蛋白表达水平柱状图；D:转化生长因子β1表达水平柱状图；E：波形蛋白表达水平柱状图；F:Smad7蛋白表达水平柱状图。*：与Oxalate组相比(P<0.05)。

2.4SOD表达量草酸损伤肾小管上皮细胞，MG132组因可缓解草酸所带来的损伤，故草酸组SOD的表达量均低于正常、MG132干预组(图4)。

图4 超氧化物歧化酶(SOD)表达量*与Oxalate组相比，P<0.05。

3 讨 论

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system，UPS)是细胞内溶酶体外蛋白降解的主要途径之一，是一种细胞内高效和高度选择性蛋白降解途径，已被认为是真核细胞内仅次于磷酸化的重要信号调节机制[7]。此外在凋亡、转录调控、增殖、细胞表面受体表达、离子通道调控、Nrf2降解等许多细胞基本进程中UPS的功能是必要的[8]。MG132是一种肽醛类蛋白酶体抑制剂，目前已经作为新的治疗靶点和治疗策略应用于蛋白酶体生物学[9]。其可以通过抑制蛋白酶体的活性来特异性阻断UPS介导的蛋白降解，可以通过减少Nrf2的降解发挥抗氧化作用，低剂量的MG132可促使Nrf2表达量增加，高剂量的MG132则发挥相反作用促使细胞凋亡及发生氧化应激[10]。

EMT是肾间质纤维化形成最重要的病理过程，肾间质纤维化形成是导致肾功能丧失的最主要的病理生理过程之一[11]。EMT形成的标志是肾小管上皮细胞失去其上皮细胞表型E-cadherin和vimentin，以此来达到破坏的肾小管基底膜转位至肾间质，分泌Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原等细胞外基质增多，从而引起肾间质纤维化[11-12]。

Smad7是Smads中的抑制剂，通过抑制Smad2/3的磷酸化来抑制TGF-β信号通路。既往研究发现破坏Smad7的功能可以加速梗阻性肾病的炎症和纤维化[13]。此外，由核因子-KB(nuclear factor-kappa B，NF-kB)激活所导致的肾脏纤维化和炎症也可以经过Smad7的表达而抑制[14]。蛋白酶体抑制剂MG132可减少Smad7的泛素化降解，进而可以抑制TGF-β/Smads信号通路的传递，通过以剂量依赖的方式抑制TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞增殖并促其凋亡[15]。

草酸对肾小管细胞的损伤及促结石作用主要是其在细胞内介导产生的ROS导致。现已认为，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是草酸诱导肾小管细胞产生ROS的主要来源[16]。NADPH氧化酶受到TGF-β的调控[17]。HONG等[18]的研究证实了阻断TGF-β1-NADPH-ROS途径的任意一个阶段均会抑制ROS的产生，因此，TGF-β1-NADPH-ROS通路是草酸诱导ROS生成的主要途径。SOD是机体内存在的一种能清除ROS的抗氧化物酶。

我们的实验结果表明，MG132可以减少草酸干预导致的TGF-β1的表达，并能显著降低草酸引起的ROS及其相关损伤后SOD的表达。故而推测MG132能通过干预TGF-β1-NADPH-ROS通路来抑制草酸诱导的ROS的产生。同时我们实验结果还显示，MG132能降低EMT形成标志的蛋白： E-cadherin和 vimentin的产生，加之KANLAYA等[5]发现草酸钙结晶通过TGF-β1 刺激上皮细胞-间质转化，故我们推测MG132是通过抑制TGF-β1/smad通路来介导抑制EMT的产生。但以上两种推测的具体机制还有待进一步研究。