张少华，王君实，董维鹏，燕炯

（山西医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，山西 太原 030001）

脂代谢紊乱和脂质合成分解障碍可致肥胖症的发生[1]。脂滴已被证实是一种在脂代谢中起重要作用的细胞器，主要成分是三酰甘油（triglyceride,TG）和胆固醇酯，脂滴表面有多种功能蛋白[2]。围脂滴蛋白（perilipin 1, PLIN1）作为PAT家族蛋白的一员，主要定位于脂滴表面，在脂肪分解代谢起屏障保护作用的一种可磷酸化蛋白[3-5]。短发卡RNA（small hairpin RNA, sh-RNA） 是 RNA干 扰（RNA interference, RNAi）技术的一种，可有效地降解同源序列的mRNA，进而抑制靶基因的表达[6]。本课题组前期已成功构建PLIN1基因的sh-RNA高效干扰载体，并已成功验证其可有效促进脂肪细胞的脂解作用[7]。

黄酮类化合物广泛存在于蔬菜水果中，具有强抗氧化性、抗肿瘤、调节血脂等生物学活性[8]。杨梅素（myricetin, Myric）作为黄酮类植物化学物中比较有代表性的的一种，可以通过降低PLIN1表达、磷酸化激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase, HSL），进而加速脂肪分解，降低TG和胆固醇[9-10]。

本研究拟通过Myric与PLIN1基因sh-RNA高效干扰载体联合干预，观察其对3T3-L1脂肪细胞脂解效率的影响，并探讨其可能机制，为今后肥胖症的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

3T3-L1前脂肪细胞系（小鼠胚胎成纤维细胞）由山西医科大学第一医院内分泌科惠赠，胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、胰蛋白酶溶液（100 ml）及青链霉素混合液（×100）购自武汉Boster生物工程有限公司，TG检测试剂盒（美国Amresco公司），甘油检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），Myric（上海阿拉丁试剂有限公司），Lipofectamine ® LTX & Plus Reagent（美国Invitrogen公司），PLIN1A抗体、HSL抗体、ATGL抗体和β-Actin抗体购自英国Abcom公司。

1.2 仪器和设备

Eon型微孔板分光光度计（美国Bio-Tek公司），DM3000B型倒置荧光显微镜（德国Leica公司），JY92-Ⅱ型超声细胞粉碎仪（宁波新芝器械研究所），DYCZ-40D型电泳仪（北京六一仪器厂），Neofuge 23R型低温高速离心机（上海Heal Force公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的复苏﹑培养及诱导分化 从液氮中取出3T3-L1前脂肪细胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，细胞长满时转移到6孔板中。

采用经典“鸡尾酒”方法对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞[11]。在细胞融合到80%左右时，将完全培养基换成诱导分化培养基Ⅰ，2 d后换为诱导分化培养基Ⅱ继续培养2 d，随后更换为基础培养基，每2天换液1次，诱导分化为成熟脂肪细胞成功后进行后续操作。

1.3.2 Myric干预条件的筛选 在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞第8天后换成含Myric的培养基，分为6组：100、50、10、5、1及0 μmol/L，每组分别干预48和72 h，检测TG和甘油含量。

1.3.3 联合干预 诱导分化为成熟的脂肪细胞后，Myric联合sh-RNA重组干扰载体进行干预实验，共分4组：联合干预组（Myric+sh-RNA）、转染组（sh-RNA）、Myric组（Myric）和空白组。

根据本课题组前期优化后的细胞转染条件，以质量体积比为1∶2的方式将质粒与脂质体转染进脂肪细胞。转染5 h后，对联合组和Myric组换成含有Myric的完全培养基继续培养72 h；对转染组和空白组换成正常的完全培养基继续培养72 h。

1.3.4 脂肪细胞油红O染色 联合干预完成后，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛溶液，室温下静置2 h。用移液管吸掉，加入油红O工作液（现配现用）。1 h后，去离子水冲洗2遍，镜下观察并拍照。

1.3.5 细胞中TG及甘油含量检测 Myric干预后，将细胞消化转移至1.5 ml EP管中，冰水浴条件下进行超声破碎，TG试剂盒检测，于酶标仪上546 nm波长处测定TG含量。甘油测定时需将细胞裂解液放于70℃水浴10 min，灭活脂肪酶，甘油试剂盒检测，于酶标仪550 nm处测定其吸光度，用蛋白浓度对测定值进行校正。

1.3.6 Western blot检测细胞中PLIN1A﹑HSL和ATGL蛋白表达 提取各组蛋白，测定并调平浓度。制备凝胶，每孔中加50 μg待测样品，样品两端的孔中加入5 μl Marker。80 V跑浓缩胶，120 V跑分离胶，220 mA恒定电流进行湿式转膜法转膜。转膜结束后，封闭2 h。用封闭液对一抗进行稀释，4℃过夜。二抗孵育时37℃摇床70 min。取出条带，加入ECL发光工作液，合上暗盒暗室曝光。Image J软件对目的蛋白条带进行分析并测定灰度值，以β-actin条带灰度值进行校正。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Myric不同浓度、不同干预时间对TG含量的影响

不同浓度Myric干预48和72 h后的TG含量比较，差异有统计学意义（F=10.823和125.113，均P=0.000）。随着Myric干预浓度的提高，细胞内TG含量逐渐降低，干预浓度达到100 μmol/L时，细胞内TG含量为最小值。100 μmol/L时48和72 h比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同剂量的Myric及不同干预时间对TG含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

表1 不同剂量的Myric及不同干预时间对TG含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

注：1）与同时间其他浓度比较，P ＜0.05；2）与同浓度48 h比较，P ＜0.05

TG 48 h 72 h 0 μmol/L 0.1 730±0.0 099 0.1 867±0.0 034 1 μmol/L 0.1 712±0.0 110 0.1 857±0.0 046 5 μmol/L 0.1 607±0.0 033 0.1 623±0.0 058 10 μmol/L 0.1 580±0.0 041 0.1 555±0.0 033 50 μmol/L 0.1 470±0.0 060 0.1 406±0.0 017 100 μmol/L 0.1 393±0.0 0301） 0.1 259±0.0 0371）2）F值 10.823 125.113 P值 0.000 0.000组别

2.2 Myric不同剂量、不同干预时间对甘油含量的影响

不同浓度Myric干预48和72 h后的甘油含量比较，差异有统计学意义（F=107.296和99.920，均P=0.000）。Myric干预后，细胞中甘油含量随着干预浓度的提高而逐渐升高，尤其当干预浓度为100 μmol/L时，甘油含量最高。100 μmol/L Myric干预48与72 h比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 Myric与sh-RNA联合作用对TG和甘油含量的影响

4组TG和甘油含量比较，差异有统计学意义（F=384.875和102.557，均P=0.000）。其中Myric+sh-RNA组细胞内TG含量最低，甘油含量最高（P＜0.05）；与空白组比较，sh-RNA组和Myric组细胞内TG含量下降，甘油含量上升（P＜0.05）。见表3。

2.4 Myric与sh-RNA联合作用对脂滴形态及分布的影响

显微镜下观察：空白组脂滴密度极大，油红O染色颜色深，大脂滴数量多；sh-RNA和Myric组脂滴呈戒环样结构围绕细胞核，与空白组比较，脂滴密度相对减小，染色颜色变浅，大脂滴数量减少；联合干预组镜下脂滴数量进一步减少，颜色进一步变浅，无大脂滴存在。见图1。

表2 不同剂量Myric及不同干预时间对甘油含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

表2 不同剂量Myric及不同干预时间对甘油含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

注：1）与同时间其他浓度比较，P ＜0.05；2）与同浓度48 h比较，P ＜0.05

甘油48 h 72 h 0 μmol/L 0.0 374±0.0 041 0.0 414±0.0 084 1 μmol/L 0.0 376±0.0 069 0.0 438±0.0 058 5 μmol/L 0.0 419±0.0 061 0.0 498±0.0 069 10 μmol/L 0.0 548±0.0 067 0.0 837±0.0 0762）50 μmol/L 0.0 947±0.0 075 0.1 220±0.0 1112）100 μmol/L 0.1 326±0.0 0721） 0.1 737±0.0 1321）2）F值 107.296 99.920 P值 0.000 0.000组别

表3 Myric与sh-RNA联合干预对TG和甘油含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

表3 Myric与sh-RNA联合干预对TG和甘油含量的影响[mmol/（g·protein），±s]

注：1）与空白组比较，P ＜0.05；2）与sh-RNA组比较，P ＜0.05；3）与 Myric组比较，P ＜0.05

组别 TG 甘油Myric+sh-RNA 0.0 873±0.0 0481）2） 0.2 194±0.0 1121）2）sh-RNA 0.1 471±0.0 0461）3） 0.1 190±0.0 0591）Myric 0.1 305±0.0 0361） 0.1 724±0.0 1011）空白组 0.1 885±0.0 016 0.0 431±0.0 051 F值 384.875 102.557 P值 0.000 0.000

2.5 Myric与sh-RNA联合作用对PLIN1A蛋白表达的影响

各组PLIN1A蛋白表达含量比较，差异有统计学意义（F=46.010，P=0.000）。Myric+sh-RNA 组PLIN1A蛋白表达含量较其他3组降低（P＜0.05）；与空白组比较，sh-RNA组与Myric组PLIN1A蛋白表达量下降（P＜0.05）。见图2。

图1 脂滴油红O染色结果 （×400）

图2 Myric与sh-RNA联合作用对PLIN1A蛋白表达的影响

2.6 Myric与sh-RNA联合作用对脂解酶HSL和ATGL蛋白表达的影响

各组HSL和ATGL蛋白表达含量比较，差异有统计学意义（F=78.222和80.831，均P=0.000）。与其他3组比较，联合干预组HSL和ATGL蛋白表达量上升（P＜0.05）；与空白组比较，sh-RNA组与Myric组HSL和ATGL蛋白表达量升高（P＜0.05）。见图3、4。

图3 Myric与sh-RNA联合作用对HSL蛋白表达的影响

图4 Myric与sh-RNA联合作用对ATGL蛋白表达的影响

3 讨论

3T3-L1前脂肪细胞是从小鼠分离出的具有特定分化潜能的细胞系，其本身不具有脂肪细胞的特性，但能被诱导分化为成熟的脂肪细胞，常被作为理想的脂代谢、细胞分化模型[12-13]。脂滴是TG在脂肪细胞中主要的储存形式。TG的分解代谢主要在ATGL和HSL的作用下进行[14-15]。

在脂肪细胞中，PLIN1蛋白锚定于脂滴表面产生支持屏障作用，将TG与脂肪水解酶隔断，保护其不被分解。研究发现，当下调PLIN1时，其屏障作用减弱，脂肪水解酶活性增强，脂解速率加快，脂滴变小，细胞内TG含量降低[16]。

Myric干预条件的筛选实验结果显示，随着Myric干预浓度的升高以及干预时间的延长，细胞内TG含量逐渐降低，甘油含量逐渐升高。通过细胞毒性实验发现当Myric干预浓度大于100 μmol/L，干预时间72 h时，细胞存活率低于80%；当干预浓度为100 μmol/L，干预时间超过72 h时，细胞存活率同样低于80%，均存在一定细胞毒性。因此，结合文献查阅结果，最终确定Myric最佳干预浓度和干预时间分别为100 μmol/L和72 h，这与QIAN WANG等[9]的研究结果相一致。

本研究结果显示，Myric+sh-RNA联合干预组较其他3组细胞内TG含量降低，甘油含量则升高，几乎观察不到大脂滴的存在，脂滴数量也减少。而联合干预组较单独干预组PLIN1A蛋白表达量更低，HSL和ATGL蛋白表达量更高。因此本实验认为，Myric与下调PLIN1基因联合作用比它们各自单独干预更能有效地促进脂肪分解，杨梅素和sh-PLIN1干扰载体引起的脂解加快可能是通过降低PLIN1A蛋白表达，上调脂肪酶HSL、ATGL的表达实现的。