张梦琦 何云霞 高诗雅 邓宇亭 李岗 陈冬梅

[摘要] 目的 检测NCX1基因在大气混合污染物处理下的高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）心肌中的表达情况，探讨大气混合污染物对肥厚型心肌病的分子影响机制。 方法 选取80只SHR大鼠随机分为对照组及低、中、高剂量组，分别以1 d、7 d、30 d、60 d、90 d五个时间点进行检测。大鼠染尘每周1次，染毒每天连续进行3.5 h；对照组气管灌注生理盐水，正常呼吸。建模完成后，杀鼠取近左心室处心肌组织提取总RNA，利用实时荧光定量PCR检测NCX1基因表达量。 结果 SHR大鼠低中高剂量组中NCX1基因在不同时间段均为高表达，差异有统计学意义（P<0.05）。随着处理剂量的增高，NCX1基因相对表达量发生明显变化的时间提前。 结论 大气混合污染物可能是通过使NCX1基因表达上调，增加胞内钙离子的浓度，使心肌收缩功能发生改变，进而参与肥厚型心肌病的发生与发展。

[关键词] 大气混合污染物；肥厚型心肌病；NCX1；实时荧光定量PCR

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0030-04

[Abstract] Objective To detect the expression of NCX1 gene in myocardium of spontaneously hypertensive rats（SHR） treated with atmospheric mixed contaminants and to explore the molecular mechanism of atmospheric mixed contaminants on hypertrophic cardiomyopathy. Methods Eighty SHR rats were randomly divided into control group， low， middle and high dose groups， and were detected at five time points： 1 d， 7 d， 30 d， 60 d， and 90 d. Rats were exposed to dust once a week for 3.5 hours per day. Controls were given tracheal infusion of normal saline and normal breathing. After the modeling was completed， the total RNA extracted from the left ventricle was extracted from the left ventricle and the expression of NCX1 gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression of NCX1 gene in the low， medium， high dose SHR group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. With the increase of treatment dose， the time for significant changes in the relative expression of NCX1 gene was advanced. Conclusion The airborne mixed pollutants may be involved in the occurrence and development of hypertrophic cardiomyopathy by up-regulating the expression of NCX1 gene， increasing the concentration of intracellular calcium and increasing the contractile function of the heart muscle.

[Key words] Atmospheric mixed pollutant； Hypertrophic cardiomyopathy； NCX1； Real-time fluorescence quantitative PCR

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種常染色体显性遗传性心肌病，典型解剖学特点是心室不对称性肥厚、心腔变小，组织学改变主要包括心肌细胞排列紊乱、小血管病变及瘢痕形成。该病的发病率约为200/10万，是青少年和运动员心源性猝死的最主要原因之一。HCM具有遗传异质性，预后差异很大，多数患者症状轻微，预期寿命可以接近常人。HCM是致病基因、修饰基因和环境因素等共同作用的结果。

大气混合污染物包括气态污染物和气溶胶污染物，前者主要有SO2、NO2和CO，后者常被称为大气颗粒物（particulate matter，PM），是空气污染中对人体健康最不利的因素。空气动力学直径≤2.5 μm的大气悬浮颗粒物称作PM2.5，亦称细粒子或细颗粒物，主要来自于煤和生物燃料（木材、木炭、动物粪便和农作物废料）的燃烧[1]、工业活动和市区汽车尾气排放[2]。2010 年5月，AHA指出大气PM2.5暴露与心血管疾病发病率和死亡率存在明确的因果关系。NCX1基因位于HCM代谢通路中，其表达量的上调或下调可能对HCM的发生和发展具有影响。

目前较少见关于大气PM2.5暴露与肥厚型心肌病之间关联的报导。本实验利用实时荧光定量PCR的方法，检测不同浓度大气混合污染物在不同时间处理下的SHR大鼠心肌NCX1基因表达量，来探讨心肌组织在转录水平对大气混合污染物处理的响应。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验对象为80只SHR大鼠（雌雄各半，体重180±20 g，10周龄），由北京维通利华实验动物公司提供，许可证号：SCXK（Beijing）2012-0001。根据随机数字表采取随机数分组法进行分组。SHR大鼠饲养温度为（22±2）℃，湿度为45%～55%，自然昼夜，自然光照，自由饮水及取食。适应性喂养1周，观察其活动与进食是否正常。将大鼠称量体重后，按随机数表分为四组：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。每个剂量组分别在1 d、7 d、30 d、60 d、90 d进行取材。

1.2 主要仪器和试剂

120F型大流量的粉尘采样器、HOPE-MED8050F液气类动态染毒系统、恒温超声振荡器、精密电子天平、全自动高压蒸气消毒锅、-80℃超低温冰箱、超净工作台、低温离心机，荧光定量PCR仪，电泳仪。RNA提取试剂盒[江苏溥搏生物科技有限公司（Probegene） MM032]，Nuclease-Free Water（Probegene），Chloroform、Isopropyl alcohol、Ethanol（国药），第一链 cDNA Synthesis Kit（Probegene MM061），2xSYBR Green qPCRMaster mix（Probegene MQ051）。

1.3 PM2.5混悬液的制备

以120F型大流量粉尘采样器进行PM2.5收集（采样流量：1000 L/min），采样地点辽宁省沈阳市交通要道。采集的含尘滤膜于-20℃保存。将含尘滤膜剪成2×2 cm2的大小，浸泡于超纯水中，超声震荡仪洗脱，六层纱布过滤后于低温超速离心机中离心（1000 r/min，4℃），收集底层颗粒物，冷冻后真空干燥，-80℃保存。生理盐水定容后配制PM2.5悬浮液。

1.4 混合气体的制备

SO2、NO2、CO的标准混合气体由大连特种气体产业公司提供，钢瓶内填充压力均为9.0 MPa，体积均为40 L。低浓度组（SO2：40.7×10-6，NO2：24.0×10-6，CO：469.2×10-6）；中浓度组（SO2：405.9×10-6，NO2：239.0×10-6，CO：4678.1×10-6）；高浓度组（SO2：2013.1×10-6，NO2：1187.0×10-6，CO：23199.6×10-6）。

1.5 引物设计

引物由上海生工合成，序列如下：

NCX1-F GCCATAACTTCACCGCAGGG

NCX1-R CTTCCCAGACCTCCACGACA

1.6 实验方法

1.6.1 实验模型的建立 染尘：采用非暴露式气管灌注方式进行染尘，每周1次，每次1 mL，对照组注入等体积生理盐水。PM2.5混悬液低、中、高剂量浓度分别为：雄鼠：0.04 mg/mL、0.4 mg/mL及4 mg/mL，雌鼠：0.03 mg/mL、0.3 mg/mL及3 mg/mL，注入的粉尘颗粒物量分别相当于国家环境质量二级标准的1倍、10倍、100倍。染毒：动态染毒系统中进行，每天连续染毒3.5 h。对照组呼吸正常空气。

1.6.2 心肌标本的采集 心脏全部取出，横截切取近左心室处，大约100 mg放入去酶EP管中，加入RNA保存液1 mL，完全浸入，4℃冰箱过夜，再置于-80℃低温冰箱保存。

1.6.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR） （1）总RNA的提取：用TRizol试剂提取心肌组织中的总RNA，并对RNA的完整性和纯度进行检测。（2）cDNA反转录及产物保存：以RNA为模板逆转录成cDNA，逆转录反应体系：Oligo（dT）15（50 μM）1.25 μL，模板RNA（总RNA）：2 μg，dNTPs（10 mM，each）2.5 μL，RTEnzyme Mix 2.5 μL，5×RT Buffer 10 μL，加RNase free ddH2O至50 μL。反应条件：50℃～55℃ 60 min，85℃ 5 min。将得到的cDNA（目的基因）在-20℃保存备用。（3）Real-time PCR：选用GAPDH为内参，引物设计由Probegene完成设计，上海生工合成。目的基因为NCX1，内参基因为GAPDH，以cDNA为模板进行复制，荧光定量PCR反应體系如下：2xSYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，Primer 1（100 μM）0.08～0.2 μL，Primer 2（100 μM），模板DNA 0.2～0.5 μL，加ddH2O至10 μL。荧光定量 PCR反应条件：94℃ 预变性2 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，68℃ 60 s，40个循环。

在反应结束时，观察PCR反应的溶解曲线，判断有无非特异性扩增及引物二聚体的产生；观察扩增曲线确定其荧光阈值（Ct值），运用相对定量（2-ΔΔt法）的方法计算 NCX1基因相对表达量。

1.7统计学分析

应用SPSS20.0统计软件对所有数据进行整理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 总RNA完整性检测

用琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE缓冲液；150v，15 min）检测RNA的完整性（封三图2），结果显示RNA完整、未被污染和降解。RNA OD260/280值符合RNA实验要求。

2.2荧光定量PCR检测结果

溶解曲线（封三图3）示全部为单峰，表示无引物二聚体的产生和非特异性扩增，扩增产物是一种物质。扩增曲线（封三图4）所示，所有的产物都进入扩增期，反应条件的设定准确。

2.3 各剂量组中NCX1基因的相对表达量情况

SHR大鼠低中高剂量组中NCX1基因在不同时间段均为高表达，差异有统计学意义（P<0.05）。随着处理剂量的增高，NCX1基因相对表达量发生明显变化的时间提前。在各剂量（低、中、高）组中，大气混合污染物处理下的1 d组NCX1基因相对表达量分别与7 d、30 d、60 d、90 d组进行两两比较。低剂量组中，1 d组NCX1基因相对表达量为（1.948±0.058），90 d组NCX1基因相对表达量为（2.107±0.061），1 d组NCX1基因表达低于90d组，差异有统计学意义（P<0.05），而1 d与7 d、30 d、60 d组间差异无统计学意义。中剂量组中，1 d组NCX1基因相对表达量为（1.764±0.089），30 d和60 d组NCX1基因相对表达量分别为（2.177±0.131）、（2.087±0.050），1 d组NCX1基因表达量低于30 d、60 d组，差异有统计学意义（P<0.05），且与30 d组的差异更大，与7 d、90 d组差异无统计学意义。在高剂量组中，1 d组NCX1基因相对表达量（1.714±0.043）与7 d（2.039±0.061）、30 d（2.009±0.029）、60 d（2.114±0.063）、90 d（1.964±0.074）组NCX1基因相对表达量差异均有统计学意义（P<0.05）。相对于低剂量组，中剂量组在30 d就出现了有统计学意义的差异；而在高剂量组，这种变化尤为明显，于第7天即开始出现有统计学意义的差异。见表1。

3讨论

NCX1即Na+/Ca2+交换蛋白，主要在心肌组织被表达，是心肌细胞膜钙转运蛋白之一[3]，在跨膜钠钙梯度和膜电位的驱动下对细胞内外Na+、Ca2+进行双向转运，交换比例为3Na+：1Ca2+[4]。正常生理条件下，NCX1以正向转运的方式外排Ca2+，与肌浆网和细胞膜上的钙泵共同维持细胞静息状态时的低钙浓度。病理条件下，NCX1则以反向转运的方式外排Na+，细胞外的Ca2+进入细胞内，导致细胞内钙超载。NCX1的mRNA和蛋白水平变化与慢性心力衰竭、糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心律失常等心血管疾病有关[5-7]。相关研究表明，心律失常和心衰患者以及肥厚心肌中出现NCX1的表达量增高[8-10]。

PM2.5粒径小，可直接进入并沉积于肺泡，甚至通过呼吸道屏障进入血液循环，顺血流侵犯全身各靶器官，造成多种组织器官的损害；又因其表面携带大量的有害物质，且能较长时间停留在空气中[11]，故PM2.5相对于PM10危害更大。PM2.5是现代心血管疾病高发的诱因之一。目前，关于PM2.5对心血管系统疾病的影响主要涉及流行病学方面的研究。大量研究表明，短期暴露于PM2.5即可导致心血管疾病死亡率增加，PM2.5每升高10 μg/m3，死亡率增加1.03%[12]。Brook等[13]对相关研究的汇总结果显示，长期暴露下，PM2.5每增加10 μg/m3，心血管死亡率增加 3%～76%。目前关于PM2.5对心血管疾病的具体机制并不十分清楚。相关研究表明，大气PM2.5主要通过对心血管系统的直接毒性和间接的氧化应激和炎症反应两方面导致心血管系统疾病[14-16]。PM2.5可以增加人体循环系统中的IL-6、TNF-α及CRP等炎症因子，导致急性血管收缩、心肌缺血和血液凝固以及降低斑块稳定性，增加急性心血管事件的发生。PM2.5可导致血管平滑肌增生，后者与各种心血管疾病的发生相关。PM2.5产生的活性氧（ROS），可對循环系统产生氧化损伤。吸入PM2.5会使血压升高，斑块稳定性降低、室性心律失常和血栓形成过程的风险增加等。

本实验运用非特异性荧光标记，相对定量的方法对NCX1基因表达量进行分析，具有简单、经济和准确的优点。荧光定量的结果显示溶解曲线均为单峰，无非特异性产物和引物二聚体，说明定量准确，结果可靠。

本实验实时荧光定量PCR结果显示：在低中高各剂量及不同的时间段中，大气混合污染物使SHR大鼠NCX1基因的相对表达量都增加，提示大气混合污染物可能是通过使NCX1基因表达上调，影响胞内钙离子的浓度，使心肌收缩功能发生改变，进而参与肥厚型心肌病形成的相关机制中。低剂量组在90 d NCX1基因相对表达量出现明显差异而中剂量组在30 d出现了有统计学意义的差异，相对于低剂量时NCX1基因相对表达量发生明显变化的时间提前。而在高剂量组，这种变化尤为明显，于第7天即开始出现明显变化。这些说明机体对于低浓度的大气混合污染物在较长时间内都有一定的代偿作用；对于较高浓度的大气混合污染物只在短时间内有代偿作用，于长期大气混合污染物暴露下机体会失代偿；当机体暴露于高浓度的大气混合污染物时，短期内就会失代偿。

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（收稿日期：2018-03-30）