冯祁军 范存义 刘师良 吴可沁 季斌

[摘要] 目的 探讨选择性环氧化酶2抑制剂对创伤后异位骨化的预防作用及对OPG/RANKL信号通路的影响。方法 实验兔随机分成对照组（C组）、模型组（M组）和帕瑞昔布低剂量组（P1组）、中剂量组（P2组）、高剂量组（P3组），M、P1、P2及P3组建立异位骨化模型，期间给予生理盐水或帕瑞昔布（4、8、12 mg/kg）。X线评估异位骨化形成情况，免疫组化方法检测OPG、RANKL蛋白的表达，RT-PCR法测定TNF-α、IL-1β mRNA的表达。 结果 与对照组比较，模型组异位骨化明显增多（P<0.05），TNF-α、IL-1β mRNA及OPG蛋白表达明显增多（P<0.05），OPG/RANKL比值明显增大（P<0.05）；与模型组比较，中、高剂量帕瑞昔布组异位骨化明显减少（P<0.05），TNF-α、IL-1β mRNA及OPG蛋白表达明显减少（P<0.05），OPG/RANKL比值明显降低（P<0.05），随着剂量增加减少越明显（P<0.05）。 结论 OPG/RANKL信号通路的激活可能是创伤后异位骨化形成的重要因素，中、高剂量帕瑞昔布能降低OPG/RANKL比值，对预防异位骨化有积极作用。

[关键词] 异位骨化；环氧化酶2抑制剂；TNF-α mRNA；IL-1β mRNA；OPG/RANKL

[中图分类号] R687.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the preventive effect of selective cyclooxygenase 2 inhibitor on heterotopic ossification after trauma and its effect on OPG/RANKL signaling pathway. Methods The experimental rabbits were randomly divided into control group（group C）， model group（group M） and parecoxib low dose group（group P1）， medium dose group（group P2）， high dose group（group P3）. M， P1， P2 and P3 groups established heterotopic ossification model. Saline or parecoxib was given（4， 8， 12 mg/kg）. Heterotopic ossification was evaluated by X-ray. Immunohistochemistry was used to detect the expression of OPG and RANKL protein， and the expression of TNF-α and IL-1β mRNA was determined by RT-PCR. Results Compared with the control group， the heterotopic ossification in the model group was increased significantly（P<0.05）. TNF-α， IL-1β mRNA and OPG protein expression was increased significantly（P<0.05）. The ratio of OPG/RANKL was increased significantly（P<0.05）； compared with the model group， the heterotopic ossification in the medium-dose and high-dose parecoxib group was significantly reduced（P<0.05）. TNF-α， IL-1β mRNA and OPG protein expression was decreased significantly（P<0.05）. OPG/RANKL ratio was significantly lower（P<0.05）. The decrease was more significant along with the increase of doses（P<0.05）. Conclusion Activation of OPG/RANKL signaling pathway may be an important factor in the formation of heterotopic ossification after trauma. Medium and high-doses of parecoxib can reduce the ratio of OPG/RANKL， which has a positive effect in the prevention of heterotopic ossification.

[Key words] Heterotopic ossification； Cyclooxygenase 2 inhibitor； TNF-α mRNA； IL-1β mRNA； OPG/RANKL

異位骨化（heterotopicossification，HO）是指在非骨组织中出现骨形成[1]，其严重影响患者肢体功能的恢复。目前HO的发病机制尚不清楚，因此很难找到有效的防治方法。传统的防治方法，如非甾体类药物因胃肠道刺激较大、血小板减少等不良反应导致部分患者停药，并且对于术后恶心、呕吐及不能进食的患者不是理想选择[2]。Kelllinsalmi等[3]研究发现选择性COX-2抑制剂帕瑞昔布可以抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制骨修复阶段成骨细胞标记分子的表达，从而抑制成骨细胞活性，可以有效预防异位骨化。研究证实[4]：护骨素（OPG）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）可直接调节成骨细胞、破骨细胞的形成及功能，OPG/RANKL系统是调节骨代谢最后的共同通路。也有学者研究发现[5]：肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素（IL-1β）是创伤后组织中重要的炎症因子，在激活OPG/RANKL信号转导通路中发挥着举足轻重的作用。然后，TNF-α、IL-1β及OPG/RANKL信号通路在异位骨化中的作用机制尚未明确。本研究拟采用Michelsson方法[6]建立异位骨化模型，观察不同剂量选择性环氧化酶2抑制剂帕瑞昔布对创伤后异位骨化的预防作用及对OPG/RANKL信号通路表达的影响，旨在探讨创伤后异位骨化的形成机制以及环氧化酶2抑制剂帕瑞昔布钠对创伤后异位骨化防治的药理作用，为防治异位骨化提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

取40只雄性新西兰白兔，体重2.5～3.0 kg，由嘉兴学院医学院动物实验中心提供，许可证号：SYXK（2014-0017）。用随机数字表法分为对照组（C组）、模型组（M组）、帕瑞昔布低剂量组（P1组）、帕瑞昔布中剂量组（P2组）、帕瑞昔布高剂量组（P3组），每组8只。

1.2 药品与仪器

注射用帕瑞昔布钠（生产厂家：Pharmacia and Upjohn Company，批准文号：国药准字J20130044，规格40 mg）；兔抗兔OPG抗体和兔抗兔RANKL抗体（美国SANTA CRUZ公司）；SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司），L-多聚赖氨酸（武汉博士德公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）。主要仪器：Motic6.0图像分析软件、光密度校正片（中国计量科学研究院）、空间校正片（厦门Motic图像分析有限公司）。RT-PCR反应仪（美国应用生物系统中国分公司）。

1.3 动物模型制备及分组处理

各组新西兰实验兔适应性喂养1周后，用水合氯醛麻醉，先行右侧股骨正侧位X摄片确保无异位骨化形成，模型组和帕瑞昔布低剂量组、帕瑞昔布中剂量组、帕瑞昔布高剂量组新西兰实验兔每天最大范围屈伸活动膝关节5 min，活动后用石膏固定右膝和右踝关节（石膏绷带制成13～15 cm长，10～12层厚，前窄后宽的3/4 管状石膏条带），右髋关节不固定，将兔放回笼内饲养。这个操作每星期6 d持续5周。操作后第1天，P1、P2、P3组即分别给予帕瑞昔布钠4、8、12 mg（kg·次），每日2次，加入适量生理盐水中静脉滴注，连续5周，对照组与模型组给予等量生理盐水静脉注射。

1.4 观察指标

1.4.1 异位骨化形成评价 各组新西兰白兔分别在造模后的第6周，摄右股骨正侧位X线片，评价异位骨化是否发生及异位骨化的范围。异位骨化形成的评价标准按照Scott等[7]的分级标准：0级，无反应；Ⅰ级，骨膜反应；Ⅱ级，异位骨形成但少于股骨长度的一半；Ⅲ级，异位骨形成大于等于股骨长度的一半。计算各组的平均分级（由两名主任医师共同评级）。（0 级例数×0+Ⅰ级例数×1+Ⅱ级例数×2+Ⅲ级例数×3）/总例数=平均分级。

1.4.2 免疫组织化学检测OPG、RANKL表达的变化 切取标本经4%多聚甲醛固定，10% EDTA溶液脱钙，石蜡包埋，切成4～5 μm薄片。切片经过常规脱蜡水化，高温抗原修复，3%过氧化氢封闭，滴加OPG和RANKL一抗，室温孵育1 h，滴加二抗，DAB显色，复染，封片，光学显微镜下判定结果。每例切片随机选取5个高倍视野，同一载玻片上OPG和RANKL染色选取相同位置的高倍视野，按染色强度及阳性细胞数所占百分比评分。染色强度分为：无色（0分），淡黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）；阳性细胞数分为：<5%（0分），5%～25%（1分），26%～50%（2分），>50%（3分）。染色强度得分乘以阳性细胞数得分相得出OPG和RANKL蛋白表达综合评分，取5个高倍视野综合评分的平均分值作为OPG和RANKL最终表达水平。计算OPG平均分值和RANKL平均分值的比值，即为OPG/RANKL比值。

1.4.3 采用RT-PCR法测定组织中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表达 取适量组织参照逆转录试剂盒说明书用TRIzol法提取组织中总RNA，反转录为cDNA。以β-actin为内参，cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，分析目的基因与内参基因吸光度。

1.5 统计学方法

采用SPSS22.0进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料用例/率表示，采用卡方检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 异位骨化造模结果

造模6周时X线摄片并计算各组平均分级，与对照组比较，模型组新西兰实验兔异位骨化明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，低剂量帕瑞昔布组異位骨化有所减少，差异无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组异位骨化明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），与中剂量组比较，高剂量组异位骨化明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

2.2 免疫组化染色结果

对各组组织标本行免疫组化染色，阳性表达着色，阴性不着色。标本中OPG和RANKL阳性表达呈棕黄色，阳性染色细胞主要为成骨细胞、骨祖细胞、破骨细胞及成纤维细胞胞浆内，呈条带状或团状分布，着色强度不一。分别对异位骨化OPG、RANKL表达情况及OPG/RANKL比值进行比较，结果如下：模型组新西兰实验兔OPG表达较对照组明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；OPG/RANKL比值明显高于对照组（P<0.05）。与模型组比较，帕瑞昔布低剂量组OPG表达及OPG/RANKL比值有所减少，差异无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组OPG表达明显减少，OPG/RANKL比值明显低于模型组（P<0.05），且随着剂量增加减少越明显，差异有统计学意义（P<0.05）。各组RANKL蛋白表达差异无显著性（P>0.05）。见表2、图2、图3。

2.3 帕瑞昔布对异位骨化组织中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表达的影响

模型组新西兰白兔TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表达较对照组明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，帕瑞昔布低剂量组TNF-α mRNA、IL-1β mRNA有所减少，差异无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表达明显减少（P<0.05），随着剂量增加减少越明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3、图4。

3 讨论

随着人工关节的广泛应用及关节切开复位内固定术的推广，近年来HO的发病率显著上升[8]。异位骨化发生后使关节活动受到限制，甚至导致关节功能丧失[9]。本实验通过反复暴力损伤软组织加长期固定的方法建立异位骨化模型，在建模过程中多次暴力损伤造成软组织出血、肿胀，影响局部血液循坏，刺激炎症反应的发生，是造成异位骨化的首要条件。长期固定可使肢体发生退行性变，软组织钙化，最终导致异位骨化形成。由建模结果可知，第6周X线可见模型组新西兰实验兔右股骨外侧异位骨化形成，影像学上与创伤所致的异位骨化相似，说明异位骨化建模是成功可靠的，有利于对异位骨化的病理和发病机制进行研究。本实验于造模开始24 h后给予静脉注射低（4 mg）、中（8 mg）、高（12 mg）剂量的帕瑞昔布，观察帕瑞昔布能否预防异位骨化形成及是否具有剂量依赖关系。结果表明，帕瑞昔布低剂量（4 mg）对异位骨化的抑制作用仅限于微观病理形态学的改变，对异位骨化的形成没有明显作用。当帕瑞昔布达到中剂量（8 mg）时对异位骨化的形成明显抑制改善，并随着药物剂量的增大，对异位骨化的抑制效果更明显。

异位骨化的组织学特征为成纤维细胞活动增加，纤维组织异常增生，继而出现玻璃样变性形成，最终钙质沉积及新骨形成[10]。破骨细胞和成骨细胞是骨质重塑过程中两个主要细胞，正常情况下维持在一定的平衡水平[11]。OPG和RANKL均主要由成骨细胞、基质细胞产生[12]，OPG可增强成骨细胞活性及分化，同时抑制破骨细胞的分化，促进钙化及骨质形成；RANKL能与破骨细胞上的RANK结合促进破骨细胞的分化并增强其活性，促进骨质破坏和吸收[13]。本研究对新西兰实验兔异位骨化组织中OPG和RANKL蛋白的表达进行检测，结果表明异位骨化组织中有OPG和RANKL蛋白表达阳性，主要位于成骨细胞、骨祖细胞、破骨细胞及成纤维细胞胞浆内。与正常组织比较，发现OPG表达在异位骨化组织中明显增加，主要由新生骨组织间成骨细胞表达并与钙质沉积的部位关系密切，提示OPG可能参与创伤后异位骨化形成过程，而且OPG/RANKL的比值也显著升高。以上结果表明，OPG/RANKL信号通路是骨代谢中重要的信号传导通路，可能在异位骨化形成过程中发挥调节作用。

TNF-α和IL-1β是OPG/RANKL信号转导通路的常见炎症激活因子[14]。TNF-α及IL-1β在炎症因子网络中处于炎症因子瀑布的最上游，介导了一系列的不同的炎性反应，当组织内高表达TNF-α及IL-1β时，促进了下游炎性细胞因子的产生，引起组织损伤[15]。Guo等[16]研究发现：TNF-α可激活OPG/RANKL信号转导通路，提高间充质干细胞迁移能力，增强碱性磷酸酶（ALP）的活性，提高骨化能力。Fukai等[17]研究發现，IL-1β可诱导成骨样细胞大量表达成骨细胞特需的基因和骨基质，间接减弱破骨细胞的诱导。IL-1β还可通过OPG/RANKL信号转导通路调节骨髓间充质干细胞成骨能力。本研究进一步对新西兰实验兔异位骨化模型组织标本中进行TNF-α mRNA、IL-1β mRNA检测发现，模型组TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的含量明显增高，提示创伤后组织中炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平上调是HO形成的重要机制。TNF-α、IL-1β在HO形成中表达增高，改变了局部组织环境，纤维细胞异常增生，OPG 合成增加及OPG/RANKL比值增加，从而抑制了破骨细胞的分化和活性，使成骨活动得到增强，钙质沉积和新骨形成增加，最终导致异位骨化的形成。

目前临床上应用非甾体类药物通过抑制环氧化酶达到预防异位骨化的目的，但确切作用机制尚需进一步研究[18]。帕瑞昔布是首个可肌肉注射或静脉滴注的选择性COX-2抑制剂，对COX-2的抑制强度是COX-1的2.8万倍[19]。随着帕瑞昔布钠的广泛应用，其生理病理学和药理学的作用越来越受到关注，特别是帕瑞昔布钠对骨代谢的作用成为近年来的研究热点[20]。从本实验研究结果看，中、高剂量帕瑞昔布可明显降低创伤后异位骨化组织中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及OPG蛋白的表达，并且下调OPG/RANKL比值，随着剂量的增加，降低程度越明显。其可能的作用机制为：帕瑞昔布钠静脉注射后迅速水解为高选择性C0X-2抑制剂伐地昔布，抑制环氧化酶-2阻止炎症反应，抑制花生四烯酸释放，进一步降低PGE表达，减少炎性因子TNF-α、IL-1β的释放，显著抑制OPG的表达，OPG/RANKL的比值显著降低，抑制成骨细胞活性及分化，钙质沉积和新骨形成减少，最终抑制异位骨化的形成。

基于以上实验研究，我们认为创伤后局部炎症因子TNF-α、IL-1β的释放及OPG/RANKL信号通路的激活可能是创伤后异位骨化形成的重要因素，选择性环氧化酶2抑制剂帕瑞昔布能够明显减轻创伤后局部炎症反应，抑制OPG/RANKL信号通路传导，从而抑制成骨细胞的分化和活化，进而抑制异位骨化形成，与传统的非甾体类药物比较具有高效能、高安全性及不良反应少的优势。对预防异位骨化具有积极重要的意义，同时也为临床上开发药物提出新的思路和实验依据。

[参考文献]

[1] Ko JK，Tompson JD，Sholder DS，et al.Heterotopic ossification of the long head of the triceps after reverse total shoulder arthroplasty[J].J Shoulder Elbow Surg，2016，25（11）：1810-1815.

[2] Yamamoto R，Matsushita M，Kitoh H，et al.Clinically applicable antianginal agents suppress osteoblastic transformation of myogenic cells and heterotopic ossifications in mice[J].J Bone Miner Metab，2013，31（1）：26-33.

[3] Kelllinsalmi M，ParikkaV，Risteli，et al. Inhibition of cyclooxy-genase-2 down-regulates osteoclast and osteoblast differentiation and favours adipocyte formation invitro[J]. Eur J Pharmacol，2007，572（2）：102-110.

[4] Peterson JR，De La Rosa S，Sun H，et al.Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model[J].Ann Surg，2014，259（5）：993-998.

[5] Sun H，Li Q，Zhang Y. Regulation of OPG and RANKL expressed by human dental follicle cells in osteoclastogenesis[J].Cell Tissue Res，2015，362：399-405.

[6] Michelsson JE，Granroth G，Andersson LC. Myositis ossificans following forcible manipulation of theleg.A rabbit model for the study ofheterotopic bone formation[J].J Bone Joint Surg Am，1980，62（5）：811-815.

[7] Scott AC，Wong S，Ang K，et al.The relative effects of indomethacin， diphosphonates and low dose radiation for the prevention of hererotopic ossification[M].Presented at the 33rd annual meeting of the Orthopaedic Research，Society，San Francisco.USA，1987.

[8] 閔红巍.异位骨化预防与治疗的新进展[J].中国康复理论与实践，2010，（10）：950-953.

[9] Popovic M，Agarwal A，Zhang L，et al. Radiotherapy for the prophylaxis of heterotopicossification：A systematic review and meta-analysis of published data[J]. Radiother Oncol，2014，113（1）：10-17.

[10] Sagi HC，Jordan CJ，Barei DP，et al.Indomethacinprophy-laxis for heterotopic ossification after acetabular fracture surgeryincreases the risk for nonunion of the posterior wall[J].Orthop Trauma，2014，28（7）：377-383.

[11] Niedz，wiedzki T，Filipowska J.Bone remodeling in the context of cellular and systemic regulation：The role of osteocytes and the nervous system[J].J Mol Endocrinol，2015，55：R23-36.

[12] Tyrovola JB，Odont XX. The "mechanostat theory" offrost and the OPG/RANKL/RANK system[J]. J Cell Biochem，2015，116（12）：2724-2729.

[13] Zeng R，Faccio R，Novack DV. Alternative NF-κB regulates RANKL-induced osteoclast differentiation and mitochondrial biogenesis via independent mechanisms[J].JBone Miner Res，2015，30（12）：2287-2299.

[14] Kassem A，Henning P，Lundberg P，et al. Porphyromonas gingivalis stimulates bone resorption by enhancing RANKL（receptor activator of NF-κB ligand） through activation of toll-like receptor 2 in osteoblasts[J].J Biol Chem，2015，290（33）：20147-20158.

[15] 幸嵘，孔清泉.异位骨化发病机制的研究进展[J].中国修复重建外科杂志，2011，（9）：1136-1139.

[16] Guo M，Shen J，Kwak JH，et al.Novel role for cyclophilinA in regulation of chondrogenic commitment andendochondral ossification[J].Mol Cell Biol，2015，35（12）：2119-2130.

[17] Fukai A，Kawamura N，Saito T，et al. Aktl in murine chondrocytes conl rols cartilage calcification during endochondral ossification under physiologic and pathologic conditions[J].Arthritis Rheum，2010，62（3）：826-836.

[18] Tan L，Taylor E，Hannam JA，et al.Pharmacokinetics and analgesic effectiveness of intravenous parecoxib for tonsillectomy adenoidectomy[J].Paediatr Anaesth，2016，26（12）：1126-1135.

[19] Inthigood N，Lertbunnaphong T，Jaishuen A. Efficacy of a single 40 mg intravenous dose of parecoxib for postoperative pain control afterelective cesarean delivery：A double-blind randomized placebo-controlled trial[J].J Obstet Gynaecol Res，2017，43（1）：92-99.

[20] Boban A，Lambert C，Hermans C. Is the cardiovascular toxicity of NSAIDS and COX-2 selective inhibitors underestimated in patients with haemophilia？[J].Crit Rev Oncol Hematol，2016，100：25-31.

（收稿日期：2018-01-19）