李日增 夏建福 蒋义 郑昭科

[摘要] 目的 探討结直肠癌组织中缺氧诱导因子-1a（HIF-1a）与microRNA-138（miR138）的表达变化及与其患者预后的相关性。 方法 选择2016年1月～2017年8月科室收治的结直肠患者70例，设为观察组，患者行手术治疗，术中取结直肠癌病灶组织；以癌旁组织设为对照组。采用免疫组织化学法完成两组HIF-1α与miR138蛋白表达测定，记录结直肠癌组织患者病理资料，包括：年龄、肿瘤直径、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移及术后复发情况，对上述病理资料进行单因素分析；采用COX回归模型分析结直肠癌组织中HIF-1α与miR138与患者预后的相关性。 结果 观察组结肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率，均高于对照组（P<0.05）；单因素及COX回归模型分析结果表明：结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与性别、年龄无相关性（P>0.05）；结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及浸润呈正相关性（P<0.05）。 结论 结直肠癌组织中HIF-1α与miR138均呈高表达，其表达水平与患者预后具有一定的相关性，加强患者HIF-1α与miR138水平测定能评估患者预后，值得推广应用。

[关键词] 结直肠癌组织；缺氧诱导因子-1α；microRNA-138；表达变化；COX回归模型

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α） and microRNA-138 （miR138） in colorectal cancer and its correlation with prognosis. Methods A total of 70 colorectal patients were selected from January 2016 to August 2017 as the observation group. The patients were treated with surgery and the colorectal cancer tissue was taken during the operation. The adjacent tissue was used as a control group. The expression of HIF-1α and miR138 protein in the two groups was determined by immunohistochemical method. The pathological data of colorectal cancer tissues were recorded including age， tumor diameter， tumor stage， differentiation， lymph node metastasis and postoperative recurrence. Data were analyzed by univariate analysis； COX regression models were used to analyze the association between HIF-1α and miR138 in patients with colorectal cancer and their prognosis. Results The positive rates of HIF-1α and miR138 in the observation group were higher than those in the control group（P<0.05）. The results of univariate and COX regression analysis showed that there was no correlation between the positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues and gender， age（P>0.05）. The positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues were positively correlated with tumor size， tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and infiltration（P<0.05）. Conclusion The expressions of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissue are high. The expression level of HIF-1α and miR138 is correlated with the prognosis of patients. Strengthening the measurement of HIF-1α and miR138 levels can evaluate the prognosis of patients and is worthy of popularization and application.

[Key words] Colorectal cancer tissue； Hypoxia-inducible factor-1α； MicroRNA-138； Expression changes； COX regression model

大肠癌属于临床上發生率较高的恶性肿瘤，包括结肠癌与直肠癌。文献报道显示[1]：大肠癌发病率由低到高依次为直肠、乙状结肠、升结肠及降结肠，其发病机制复杂，多与生活方式、遗传及大肠腺瘤有关，且疾病发生率呈年轻化趋势，影响我国居民健康及生活。目前，临床上对于结直肠癌以手术治疗为主，通过手术能切除病灶组织，延长患者寿命，但是多数患者术后5年生存率仅50.0%[2]。因此，加强结直肠癌患者早期诊断、治疗对改善患者预后具有重要的意义。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在肿瘤的发生、发展中发挥了重要的作用，能促进肿瘤的侵袭、转移，能在多种机制下促进肿瘤糖酵解[3]。microRNA属于是一种单链非编码小片段RNA调控分子，能参与调节细胞的生长发育、分化及凋亡[4]。microRNA-138是microRNA的一种，在结直肠癌的发生、发展中发挥作用。因此，加强HIF-1α与miR138水平测定及研究与患者预后的相关性能为患者治疗提供依据和参考。本课题以2016年1月～2017年8月科室收治的结直肠患者70例，探讨结直肠癌组织中HIF-1α与miR138的表达变化及与其患者预后的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月～2017年8月科室收治的结直肠患者70例，设为观察组，男42例，女28例，年龄36～75岁，平均（57.58±5.61）岁。肿瘤分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期31例。淋巴结转移：转移25例，无淋巴结转移45例；是否浸润：发生浸润21例，未发生浸润49例。分化程度：低分化23例，中分化21例，高分化26例。预后：预后良好52例，预后差18例。以癌旁组织设为对照组。本课题得到医院伦理委员会同意，患者对检测方案签署同意书。

1.2 纳入、排除标准

纳入标准：（1）符合结直肠癌临床诊断标准[5]，患者均经手术病理检查最终确诊；（2）能耐受手术治疗，能遵循医嘱完成相关检查、治疗者。

排除标准：（1）合并严重心、肝、肾功能异常及伴有明显精神异常者；（2）合并多种恶性肿瘤者；（3）合并糖尿病、高血压、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病者[6]。

1.3 主要仪器和试剂

本课题所需的仪器与试剂包括：包埋机（型号EG1150H）、脱水剂（型号ASP300S）、鼠抗人HIF-1α单克隆抗体（NBP1-30333）、鼠抗人miR138单克隆抗体、EDTA（ZLI9069）、免疫组化试剂盒（SP9001），其厂家见表1。

1.4 方法

（1）检测方法。采用免疫组织化学法完成两组HIF-1α与miR138蛋白表达测定：①标本采集。围术期取病灶部位组织，采用免疫组织化学法测定两组HIF-1α与miR138蛋白表达。②检测方法。向制备的切片组织中放入1份30.0%H2O2及10份蒸馏水，加入内源性酶常温下10 min灭火，采用蒸馏水连续3次洗涤。将切片放置在0.01 M枸橼酸盐缓冲液调节溶液pH值为6.0，利用电炉加热，煮沸后间隔5 min，连续反复2次，常温下冷却后加入PBS进行2次洗涤，常温下加入浓度5%BSA封闭液，甩去多余液体后加入一滴HIF-1α与miR138蛋白（稀释浓度为1：100）单克隆抗体，采用PBS3次洗涤，每次2 min。采用DBA显色试剂盒中在1 mL底物中加入1滴HIF-1α与miR138蛋白二抗，混合均匀后制备DBA工作液，常温下显色，完毕后利用苏木素复染、脱水、透明后封片，倒置显微镜下观察阳性细胞时数量占总细胞数量的比例，每个标本测定3次，取平均值[7]。③判定方法。以细胞膜和（或）细胞质中出现棕黄色颗粒或团装视为阳性。参考奥尔雷德评分标准从细胞阳性数（1～4分）及染色强度（0～12分）进行判断，得分越高，阳性率越高。评定时每个标本连续测定3次，在200倍光镜下取5个视野，取平均值[8]。（2）病理资料的统计。采用免疫组织化学法完成两组HIF-1α与miR138蛋白表达测定，记录结直肠癌组织患者病理资料，包括：年龄、肿瘤直径、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移及术后复发情况，对上述病理资料进行单因素分析[9]；参考WHO实体瘤标准对患者手术后治疗效果从CR（完全缓解）、PR（部分缓解）、PD（疾病进展）、SD（疾病稳定）角度进行评估，将CR+PR视为预后良好；PD+SD视为预后差。（3）相关性。采用COX回归模型分析结直肠癌组织中HIF-1α与miR138与患者预后的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用[n（%）]表示，计量资料行t检验，采用（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HIF-1α与miR138阳性率比较

观察组结肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率，均高于对照组（P<0.05）。见表2、封三图1。

2.2 结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率表达单因素分析

单因素结果表明：结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与性别、年龄无相关性（P>0.05）；结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及浸润呈正相关性（P<0.05）。见表3。

2.3 结直肠癌组织中HIF-1α与miR138与预后的相关性研究

COX回归模型分析结果表明：结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及浸润呈正相关性（P<0.05）。见表4。

3 讨论

结直肠癌均为临床上常见的恶性肿瘤，且发生率呈上升、年龄化趋势，严重影响我国居民健康[10]。由于结直肠癌发病早期临床症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊，已经是中、晚期，丧失了最佳治疗时机。因此，加强患者早期诊断、治疗对改善患者预后具有重要的意义[11]。

HIF-1具有HIF-1α、HIF-1β两种亚型，而HIF-1α是肿瘤细胞缺氧状态下适应的中心调节因子，多与肿瘤细胞血管的形成、增殖及转移有关。对于正常人而言，HIF-1α主要以解离状态存在，导致其暂时丧失活性。但是，当机体组织细胞处于低氧状态时HIF-1α将会与HIF-1β相互结合，导致其表达水平迅速升高，有助于促进新生血管的形成，加快肿瘤的转移[12-13]。本研究中，观察组结肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率，均高于对照组（P<0.05）。提示：HIF-1α在结直肠癌组织中呈高表达，能直接参与疾病的发生、发展。研究表明：无限增殖是肿瘤细胞最重要的特征，不断快速增殖能引起肿瘤细胞氧耗增加，而当肿瘤细胞所需的氧超过组织供给时将会发生缺氧。此外，HIF-1α能通过多种途径诱导肿瘤细胞产生耐药，削弱患者治疗效果。miR138参与抑郁等精神活动有关，能抑制机体免疫反应及新生血管的形成。文献报道显示[13]：miR138能参与新生血管的形成，能抑制血管内皮因子诱导血管内皮细胞发生增殖、迁移。同时，miR138能参与多种恶性肿瘤的发生、发展，并且在肿瘤干细胞中miR138多呈高表达，会引起肿瘤细胞发生上皮-间质转换，能提高肿瘤标志物水平[14]。本研究中，单因素及COX回归模型分析结果表明：结直肠癌组织中HIF-1α与miR138阳性率与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及浸润呈正相关性（P<0.05）。提示：结直肠癌组织中HIF-1α与miR138均呈高表达，并且表达水平受到的影响因素有关。为了提高患者治疗效果，改善患者预后，患者手术治疗过程中可加强HIF-1α与miR138水平监测，动态了解及评估患者疾病严重程度，善于根据监测结果调整治疗方案，使得患者的治疗更具科学性、合理性[15]。

综上所述，结直肠癌组织中HIF-1α与miR138均呈高表达，其表达水平与患者预后具有一定的相关性，加强患者HIF-1α与miR138水平测定能评估患者预后，值得推广应用。

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（收稿日期：2018-01-09）