吴勤祥 李好朝 乔泽强 贾廷印

(河南南阳医学高等专科学校第一附属医院普通外科二病区,南阳473058)

肝癌是全球六大恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康。2012年全球新增肝癌病例78.2万，肝癌死亡人数约74.5万[1]。2012年中国新增肝癌病例42.4万，肝癌死亡人数约32.1万[2]。可见中国是全球肝癌负担最为严重的地区。到2013年中国肝癌死亡人数约35.8万，到2015年肝癌死亡人数增加到42.2万，肝癌是造成中国严重疾病负担的恶性肿瘤之一[3,4]。肝癌给患者和社会带来了严重的负担。寻找有效的肝癌治疗药物对人类健康事业具有重要意义。柴胡作为一种具有悠久历史的传统草药，来源于柴胡及狭叶柴胡的干燥根，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌、退热及保肝等功效，在中国、日本、韩国等亚洲国家被广泛用于流感、发烧、炎症、疟疾等疾病的治疗[5]。柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSd)(化学结构式见图1A)是柴胡的主要活性成分之一，属于多萜类衍生物。柴胡皂苷D在多种癌症中都呈现了抗癌的作用，如肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤及肝癌等[6]。本文主要目的在于探索柴胡皂苷D对肝癌HepG2细胞增殖凋亡和裸鼠肝癌形成的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系及主要试剂 人肝癌细胞系HepG2来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。柴胡皂苷D购自美国Sigma公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学公司。细胞凋亡检测试剂盒Annexin V Apoptosis Detection Kit购自美国BD公司。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色试剂盒购自美国罗氏公司。抗Ki67和抗cleaved caspase-3抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与药物处理 HepG2细胞置于添加了10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中，在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞增殖到80%左右时，PBS洗涤后用胰酶消化2 min，加入细胞培养液终止消化，1 500 r/min，23℃离心5 min，弃去上清，收集细胞并立即重悬细胞，1∶5 传代培养。HepG2细胞分为4组：柴胡皂苷D组(0.1、0.5、1 μmol/L处理)，对照组用等量的DMSO处理。

1.2.2CCK-8检测细胞增殖 收集不同浓度(0、0.1、0.5、1 μmol/L)柴胡皂苷D处理的HepG2细胞，用已经稀释到10%的CCK-8溶液将各组细胞制成1×106个/ml的细胞悬液，并在37℃培养1～4 h，检测450 nm处吸光度值计算细胞增殖倍数。

1.2.3流式细胞术分析细胞凋亡 柴胡皂苷D处理细胞48 h后，收集各组HepG2细胞，PBS漂洗后用1×Binding buffer制成1×106个/ml的细胞悬液。再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，最后利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.2.4蛋白印迹 柴胡皂苷D处理细胞24 h后，用PBS清洗待测细胞3次后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解并提取总蛋白，100℃变性5 min。等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，5%的BSA室温下封闭1 h，加入相应的一抗，4℃过夜孵育，随后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.2.5小鼠模型建立及药物处理 4周龄裸鼠购自中国科学院实验动物中心。通过皮下注射3×106个HepG2细胞建立肝癌小鼠模型。当肿瘤体积长到100～120 mm3时被认为肿瘤形成，并将裸鼠随机分为3组：对照组、假手术组和柴胡皂苷D组，每组5只，并开始记录为实验的第1天。柴胡皂苷D组进行腹腔注射柴胡皂苷D(20 mg/kg)；假手术组腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.6TUNEL染色 颈椎脱臼法处死裸鼠后取肝脏组织用PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块，多聚甲醛(4%)在4°C下固定24 h，PBS清洗后用30%、50%和70%的酒精依次清洗。然后进行脱水，再进行石蜡包埋切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后于常温下用蛋白酶K处理15 min。PBS漂洗后滴加TUNEL反应混合液于标本上，37℃暗盒中反应1 h。PBS漂洗3次晾干后滴加辣根过氧化物酶结合的POD于标本上，37℃暗盒中反应30 min。漂洗后滴加DAB底物，室温下反应10 min。PBS漂洗后苏木素复染5 s，自来水冲洗，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后用中性树胶进行封片，显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为阳性细胞。

1.2.7免疫组织化学染色 首先肝脏组织的石蜡切片经脱蜡再水化后用Triton-100(1%)处理15 min，H2O2(3%)处理15 min。5% 的羊血清封闭30 min，4℃下过夜孵育一抗，第二天加入二抗，37℃孵育30 min。最后进行染色封片。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05认为存在明显差异，P<0.01认为存在显著差异，P<0.001认为存在极显著差异。

2 结果

2.1柴胡皂苷D对HepG2细胞增殖的影响 利用CCK-8检测HepG2细胞增殖倍数。如图1B所示，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D组细胞增殖倍数与对照组无明显差异。0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D处理HepG2细胞4 d后，细胞增殖倍数明显降低(P<0.05)。上述结果说明，中高浓度(0.5 μmol/L和1 μmol/L)的柴胡皂苷D会抑制HepG2细胞增殖。

图1 柴胡皂苷D化学结构式(A)和CCK-8检测HepG2细胞增殖(B)Fig.1 Chemical structure of saikosaponin D(A) and proliferation of HepG2 was detected by CCK-8(B)Note: *.P<0.05 vs.control group.

2.2柴胡皂苷D可促进HepG2细胞凋亡 通过流式细胞术分析柴胡皂苷D对HepG2细胞凋亡的影响。Q4象限代表早期凋亡的细胞，Q2象限代表的是晚期凋亡的细胞。由图2可知，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。以上结果表明，柴胡皂苷D能提高HepG2细胞凋亡。

2.3柴胡皂苷D对细胞增殖和凋亡标记蛋白表达的影响 用蛋白印记检测HepG2细胞增殖和凋亡标记蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表达。图3显示，0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的柴胡皂苷D组Ki67表达明显低于对照组，cleaved caspase-3表达明显高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，1 μmol/L的柴胡皂苷D组Ki67表达显著下降，cleaved caspase-3表达显著升高(P<0.01)。由此可见，柴胡皂苷D可减弱细胞增殖标记蛋白的表达，并增强细胞凋亡标记蛋白的表达。

2.4柴胡皂苷D会抑制裸鼠肝癌肿瘤形成，提高存活率 通过测量肝肿瘤体积及统计裸鼠存活率，分析柴胡皂苷D对裸鼠肝癌形成及存活率的影响。图4A显示，假手术组裸鼠肿瘤体积与对照组无明显差异，柴胡皂苷D组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05)。由图4B可知，对照组和假手术组裸鼠存活率无明显差异。肿瘤形成的21 d之内柴胡皂苷D组裸鼠存活率维持在100%，在肿瘤形成的24 d后存活率急剧降低，约下降30%。上述结果表明，柴胡皂苷D可抑制肝癌肿瘤的生长，提高存活率。

2.5柴胡皂苷D可提高肝癌肿瘤组织细胞凋亡 利用TUNEL染色检测肝癌肿瘤组织细胞凋亡。如图5所示，假手术组与对照组肿瘤组织中凋亡小体数目无明显差异，柴胡皂苷D组凋亡小体数目极显著地高于对照组(P<0.001)。以上结果说明，柴胡皂苷D会促进肝癌肿瘤组织细胞凋亡。

图2 流式细胞术检测HepG2细胞凋亡Fig.2 Apoptosis of HepG2 was measured by flow cytometryNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

2.6柴胡皂苷D对肝癌肿瘤组织增殖和凋亡标记蛋白表达的影响 免疫组化检测肝癌肿瘤组织增殖和凋亡标记蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表达。

图6显示，对照组和假手术组肿瘤组织Ki67和cleaved caspase-3表达水平无明显差异。与对照组相比，柴胡皂苷D组肿瘤组织Ki67表达显著减弱，cleaved caspase-3表达显著增强(P<0.01)。以上结果说明，柴胡皂苷D可降低肿瘤组织细胞增殖标记蛋白的表达，并提高肿瘤组织细胞凋亡标记蛋白的表达。

图3 蛋白印迹检测HepG2细胞增殖和凋亡标记蛋白表达Fig.3 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in HepG2 were tested by Western blotNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

图4 肿瘤体积(A)、小鼠存活率(B)检测和肿瘤照片Fig.4 Tumor volume(A),survival (B) detection and photograph of tumorNote: *.P<0.05 vs.control group.

图5 TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡Fig.5 Apoptosis of tumors were detected by TUNEL stainingNote: ***.P<0.001 vs.control group.

图6 免疫组化检测肿瘤组织增殖凋亡标记蛋白表达Fig.6 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in tumors were measured by immunohistochemical stainingNote: **.P<0.01 vs.control group.

3 讨论

目前对肝癌的治疗可分为早中晚三个时期的治疗，每个阶段都有不同的治疗方法。对还保有肝功能且无门静脉高压症的早期肝癌患者一般选择手术切除，对重度肝硬化的早期肝癌患者则需要肝移植。中期肝癌患者一般需要进行经动脉栓塞治疗或放射性栓塞治疗。晚期肝癌患者大部分都不再适合外科手术，现阶段晚期癌症治疗手段主要包括靶向药物索拉菲尼的使用，免疫治疗及溶瘤病毒治疗等[7]。然而这些方法的疗效都十分有限，且常常伴有较大的副作用。据报道，传统中药与常规癌症治疗的结合有助于肝癌的治疗[8]。目前已经发现大量有利于疾病治疗的天然产物。

大量文献报道了多种植物提取物具有抑制癌细胞增殖的功能。有数据显示芦荟花提取物和猫眼草提取物具有降低肝癌HepG2细胞增殖的功效[9,10]。Hu等[11]发现女贞果实提取物可抑制肝癌Bel-7402细胞增殖。据报道来源于缕丝花的异荭草苷处理肝癌HepG2细胞会降低细胞增殖能力[12]。有研究表明柴胡皂苷D可抑制晚期前列腺癌CWR22Rv1细胞增殖[13]。Hu等[14]发现柴胡皂苷D可抑制黑色素瘤A375.S2细胞增殖。据报道在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中，柴胡皂苷D可抑制细胞增殖[15]。本研究结果显示，中高浓度(0.5和1 μmol/L)的柴胡皂苷D会抑制肝癌HepG2细胞增殖，降低Ki67的表达。

越来越多的研究表明许多植物提取物都可以诱导癌细胞凋亡。Byambaragchaa等[16]发现雪莲乙醇提取物会增强肝癌HepG2细胞凋亡，上调cleaved caspase-3表达。有研究发现闭鞘姜甲醇提取物可增强肝癌HepG2细胞凋亡，提高caspase-3活性[17]。据报道芍药根和丹参根提取物可提高肝癌HepG2和 SMMC-7721细胞凋亡，增强cleaved caspase-3表达[18]。Yao等[19]发现柴胡皂苷D可诱导前列腺癌DU145细胞凋亡，增强cleaved caspase-3表达。有研究表明柴胡皂苷D可提高肾细胞癌细胞凋亡[20]。在胶质瘤细胞U87中，柴胡皂苷D处理可增强细胞凋亡，提升cleaved caspase-3表达[21]。也有报道柴胡皂苷D可促进宫颈癌Hela和乳腺癌MCF-7细胞的细胞凋亡[22]。本文结果显示，柴胡皂苷D能提高HepG2细胞凋亡，增强cleaved caspase-3表达。

大量研究发现植物提取物可通过抑制肿瘤生长达到抗癌的功效。Huang等[23]通过体内研究显示异槲皮苷可抑制肝癌肿瘤生长。据报道石榴皮提取物可提高二乙基亚硝胺诱导的肝癌小鼠存活率，抑制肿瘤生长[24]。也有研究表明柴胡皂苷D和阿霉素混合物可降低乳腺癌肿瘤组织的生长速度[25]。柴胡皂苷D可抑制甲状腺癌肿瘤的生长[26]。本研究结果显示，柴胡皂苷D可下调肝癌肿瘤组织Ki67表达，抑制肿瘤生长，提高存活率。

许多植物提取物在肿瘤组织细胞凋亡方面也发挥着积极作用。在二乙基亚硝胺和2-乙酰氨基芴诱导的肝癌大鼠中，黄柏提取物可增强肿瘤组织细胞凋亡[27]。在用肝癌细胞H22建立的荷瘤小鼠中，川楝子提取物可增强肿瘤组织细胞凋亡[28]。Cheng等[29]发现泽漆乙酸乙酯提取物可诱导肝癌肿瘤组织细胞凋亡。本文结果表明，柴胡皂苷D会提高肿瘤组织cleaved caspase-3表达，促进肿瘤组织细胞凋亡。

综上所述，在肝癌HepG2细胞中，柴胡皂苷D处理会抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，下调Ki67表达，增强cleaved caspase-3表达。而且，柴胡皂苷D还可抑制肝癌肿瘤组织生长，提高存活率，综上所述，柴胡皂苷D具有抑制人肝癌HepG2细胞系增殖和裸鼠肝癌形成的作用。我们下一步计划将通过体内体外实验研究柴胡皂苷D对肝癌侵袭和转移的影响。