车 楠 李 莉 李良昌 赵洪伟

(延边大学医学院，延吉133002)

哮喘是支气管气道的慢性炎症性疾病，其特征在于慢性气道炎症，气道高反应性，黏液过度分泌和气道重构。气道平滑肌增生、气道基底膜增厚、上皮下纤维化增殖、胶原沉积等均可导致气道重构，是哮喘预后不良的重要原因[1]。Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) 信号通路在哮喘中具有至关重要的作用，可以促进气道炎症和高反应性，上调T辅助细胞因子水平并增加黏液产生[2]。Yang等[3]研究发现PI3K/Akt可活化核因子κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)的抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB) 激酶加速IκB的降解,促进NF-κB的核转位,增强NF-κB 的转录活性。NF-κB活化后促进基质金属蛋白酶9 (Matrix metalloprotein 9,MMP-9)的基因转录进一步发挥促气道重构的作用[4]。桦褐孔菌多糖(Polysaccharide from Inonotus oblipuus，PIO)是药用菌类桦褐孔菌(Inonotus oblipuus)的重要活性成分具有显著的抗炎、抗癌、抗氧化以及抗糖尿病等[5]。研究表明，PIO具有抗哮喘作用[6]，但是其对于哮喘气道重构的作用以及机制尚无详细研究。因此本研究利用OVA诱导建立哮喘小鼠气道重构模型，给予PIO治疗，探讨PIO对气道重构的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1药品、试剂和仪器 OVA(Sigma，美国)；IL-4、IL-5、IL-13和MMP-9 ELISA试剂盒(Invitrogen,美国)； Masson三色染色液(索来宝，中国)；anti-NF-κB p65(6956)，anti-MMP9(3852)，anti-PI3K(4255)，anti-p-PI3K(4228),anti-AKT(9272)，anti-p-Akt(9275)(Cell Signaling,美国)；β-actin，PARP(Santa Cruz，美国)；402型雾化器(四菱医疗器械厂，上海)；酶联免疫检测仪，电泳设备和Gel Doc凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)；桦褐孔菌多糖由延边大学药学院提取。

1.2方法

1.2.1气道重构模型建立与分组 雌性BALB/c小鼠40只，体重(18±5)g，由延边大学医学部实验动物中心提供，标准条件下适应性饲养1周。随机分为对照组、模型组、桦褐孔菌多糖低剂量组(PIO-100)、桦褐孔菌多糖高剂量组(PIO-200)。除正常组外，其余各组小鼠于第1天和第7天腹腔注射溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的100 μg OVA 和氢氧化铝混合液0.5 ml进行致敏。第12天，OVA(1 mg/ml,溶于生理盐水中)雾化吸入激发30 min,第19、20、33、34、47、48、61、62、75、76、89、90天以同样的方法在同样时间激发,共13次。桦褐孔菌多糖组分别在激发前灌服PIO 100或200 mg/(kg·d)。

1.2.2实验样本获取与处理 末次激发48 h后处死小鼠。收集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)利用血球计数仪计细胞总数。4℃，3 000 r/min离心5 min，留取上清，于-80℃保存，待测细胞因子。细胞涂片后Diff-quik染色，镜下进行细胞分类计数。取右肺下叶，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色和Masson染色观察。其余各肺叶液氮速冻后-80℃保存待用。

1.2.3BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量的ELISA分析 按说明书操作，结果单位以pg/L表示。

1.2.4Western blot分析 参照文献[7]方法。BCA方法测定蛋白浓度，上样量20 μg总蛋白，10%SDS-PAGE胶上进行电泳分离，然后250 mA、90 min电转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉TBS-T缓冲液孵育1 h封闭，按1∶1 000加入相应的稀释抗体4℃过夜。第2天，洗膜后按1∶2 500孵育二抗1 h。加ECL发光试剂，利用Gel Doc进行图像采集。

2 结果

2.1PIO减弱哮喘气道重构小鼠BALF中的细胞变化。如图1所示，与对照组相比，模型组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞，淋巴细胞和嗜中性粒细胞数量均显著增加(P<0.05)；PIO干预后，能够明显降低OVA诱导的炎症细胞的增多。

2.2PIO能够缓解哮喘气道重构小鼠的肺部病理变化。HE染色和Masson染色结果显示，模型组小鼠气道重构现象明显：气道黏膜水肿，上皮细胞增生，气道壁内平滑肌明显增厚，气道痉挛收缩，管腔狭窄，胶原过度沉积，气道及血管周围大量炎性细胞浸润。与模型组相比，PIO干预后的哮喘气道重构小鼠肺组织切片中炎性细胞浸润显著减少，气道结构比较完整，平滑肌增厚以及胶原沉积现象明显得到改善(图2)。

2.3PIO能够降低哮喘气道重构小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的升高。如图3所示，ELISA结果显示，模型组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平明显高于对照组(P<0.05)。而PIO能够明显降低哮喘气道重构小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平(P<0.05)。

图1桦褐孔菌多糖对哮喘气道重构小鼠BALF中细胞总数及组成的影响

Fig.1Effectofpolysaccharidefrominonotusoblipuusontotalanddifferentialcellularcomponentsofbronchoalveolarlavageinasthmaticmice

Note: A.Diff-quick staining of cells in BALF(×200,the arrows point to eosinophils);B.The changes of the inflammatory cells in BALF.#.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

图2 桦褐孔菌多糖对小鼠肺部炎症的影响(×200)Fig.2 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on pathologic changes in lung tissues in asthmatic mice(×200)

图3 桦褐孔菌多糖BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影响Fig.3 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on Th2 cytokines such as IL-4，IL-5，IL-13 in bronchoalveolar lavage fluids of asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

2.4PIO降低哮喘气道重构小鼠AHR。如图4所示，与对照组相比，模型组小鼠乙酰胆碱雾化后的气道反应性明显升高；但是PIO的干预可以抑制哮喘气道重构小鼠的气道高反应(P<0.05)。

2.5PIO通过调控PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9抑制哮喘气道重构。Western blot结果显示，模型组中p-PI3K和p-AKT表达水平明显升高(P<0.05)，而PIO能够降低哮喘气道重构小鼠肺组织p-PI3K和p-AKT的表达，并呈剂量依赖(P<0.05)(图5A)。如图5B所示，模型组中，NF-κB的核转移以及MMP-9表达水平明显升高(P<0.05)。PIO干预能够降低哮喘气道重构小鼠肺组织NF-κB的核转移以及MMP-9的表达水平(P<0.05)。MMP-9的ELISA检测结果表明，与模型组相比，PIO干预后均下调哮喘气道重构小鼠BALF中MMP-9的表达(图5C)。

2.6PIO对哮喘气道重构小鼠WNT 5A表达的影响。Western blot结果显示，模型组中WNT 5A表达水平明显升高(P<0.05)，而PIO能够降低哮喘气道重构小鼠肺组织WNT 5A的表达(P<0.05)(图6)。

图4 桦褐孔菌多糖对气道高反应性的影响Fig.4 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on airway hyperresponsiveness in asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

图5 桦褐孔菌多糖对PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9表达的影响Fig.5 Effect of polysaccharide from inonotus oblipu-us on PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9 signaling pat-hway in asthmatic miceNote: A.WB of PI3K and Akt in lung tissue;B.WB of NF-κB and MMP-9 in lung tissue;C.ELISA of MMP-9.#.P<0.05 vs CON；*.P<0.05 vs OVA.

图6 桦褐孔菌多糖对WNT 5A表达的影响Fig.6 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on expression of WNT 5A in asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

3 讨论

气道重构的病理学特征是由于胶原蛋白沉积，杯状细胞增生，气道平滑肌厚度增加，新生血管增多等导致的上皮增厚[1]。目前哮喘的治疗主要是使用吸入性皮质类固醇。虽然这些药物在抗哮喘炎症方面非常有效，但它们在调节气道重构方面效果十分有限，并且长时间高剂量使用时会产生严重的副作用。从桦褐孔菌中提取的多糖具有抗氧化性能，可用于自由基清除和抗炎治疗，并且无副作用，已成为食品和药品研究的重点[8]。本研究结果表明，PIO能够抑制气道重构小鼠肺组织病理学改变，炎症细胞浸润，气道高反应性，BALF中细胞因子的水平。这一结果表明，PIO对于哮喘气道重构具有抑制作用。接下来我们又探讨了PIO抗气道重构可能的作用机制。PI3K通过调节基础细胞反应，包括增殖、分化和细胞迁移，在各种炎症细胞中发挥重要作用。Takeda等[9]研究表明，在PI3Kγ缺陷小鼠中，炎性细胞积聚、气道重构和气道高反应性等现象明显缓解。此外，PI3K抑制剂，LY294002和Wortma-nnin均显示在哮喘模型中发挥作用[10]。Akt是PI3K的下游效应子，是PI3K的直接靶基因，也是该途径的中心环节。通常，Akt磷酸化可以用作PIK3活性的指标[11]。作为PI3K/Akt途径的下游靶标，NF-κB是加剧炎性疾病的关键调节剂[3]。MMP-9是参与哮喘的主要蛋白酶之一，在气道重构中发挥重要作用，能够促使气道壁胶原沉积，气道狭窄，因此导致气道功能障碍。我们在研究中发现，p-PI3K、p-Akt和MMP-9的表达以及NF-κB核转移受到PIO的抑制，而在哮喘气道重构模型中则显著增加。近年来研究表明，WNT 5A参与激活PI3K信号通路并与哮喘气道炎症和气道重构关系密切，本实验研究显示PIO能够抑制哮喘气道重构小鼠肺组织WNT 5A表达的增加，暗示WNT 5A可能参与哮喘气道重构。

综上所述，本研究表明PIO可能通过PI3K/Akt/NF-κB/MMP-9信号抑制哮喘炎症和气道重构。