王永阳　杜佳　高克祥

摘要：为绿色防控苦瓜枯萎病，本研究从苦瓜根际土中分离出多株木霉，通过平板对峙培养法和盆栽防病试验进行拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌株筛选，对筛选到的菌株进行形态学及分子生物学鉴定，并运用实时荧光定量PCR技术对其在苦瓜植株及土壤中的定殖能力进行检测。结果表明：筛选得到两株防效较好的木霉菌株M2和MX，对苦瓜枯萎病的防治效果分别达54.63%和45.72%。结合形态学和分子生物学鉴定，确定M2菌株為绿木霉（Trichoderma virens），MX菌株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。木霉菌株M2和MX均不能在苦瓜植株中定殖，但在土壤中可以稳定定殖。两个木霉菌株具有应用于苦瓜枯萎病的田间生物防治潜力。

关键词：绿木霉；棘孢木霉；苦瓜枯萎病；生物防治；实时荧光定量PCR

中图分类号：S436.429：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0110-06

Screening and Identification of Biocontrol Trichoderma to Wilt of

Bitter Gourd and Detection of Its Colonization by qPCR

Wang Yongyang， Du Jia， Gao Kexiang

（College of Plant Protection， Shandong Agricultural University/Shandong Provincial Key Laboratory for

Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests， Taian 271018， China）

Abstract In order to prevent and control the wilt of bitter gourd caused by Fusarium oxysporum， several Trichoderma strains was isolated from rhizosphere soils of bitter gourd field in this study. Trichoderma strains that had good control effects on the wilt of bitter gourd were screened by plate confrontation test and pot culture test， then the strains were conducted morphological and molecular biological identification. The colonization ability of screened strains of Trichoderma in the plants and soils of bitter gourd was detected by real-time PCR. The results showed that two Trichoderma strains M2 and MX had better control effect on wilt of bitter gourd with the control efficiency of 54.63% and 45.72%， respectively. According to the morphological and molecular biological identification， strain M2 was identified as Trichoderma virens， and strain MX was identified as Trichoderma asperellum. Strain M2 and MX could not be colonized in plants of bitter gourd， but they could be steadily colonized in soils. They could be applied in biocontrol of wilt of bitter gourd in field.

Keywords Trichoderma virens； Trichoderma asperellum； Wilt of bitter gourd； Biocontrol； Real-time fluorescence quantitative PCR

苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型引起的一种重要土传病害[1]，传播速度快，防治十分困难，生产上常用的药剂防治方法对苦瓜枯萎病的控制效果并不理想，且滥用化学药剂还会造成严重的环境污染[2]。因此利用生防菌对苦瓜枯萎病进行生物防治很有必要。木霉菌（Trichoderma spp.）作为生产上广泛使用的一种生防菌，已报道其对多种主要植物病原真菌如腐霉菌、轮枝菌、镰刀菌、长蠕孢菌、交链孢菌、丝核菌、葡萄孢菌等有较好的拮抗活性[3-5]。为绿色防控苦瓜枯萎病，本研究从苦瓜根际土壤中分离纯化出多株木霉菌株，采用平板对峙培养法和盆栽防病试验进行拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌株筛选，并对筛选到的菌株进行形态学及分子生物学鉴定，利用实时荧光定量PCR技术对其在苦瓜组织及土壤中的定殖能力进行评估，以期为深入开发该生防菌株提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物病原菌：苦瓜枯萎病菌 （Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）、苹果霉心病菌（ Alternaria alternata）、苹果树腐烂病菌 （Valsa mali）、核桃炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、杨树水泡溃疡病菌（Botryosphaeria ribis）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜褐斑病菌 （Corynespora cassiicola）、甘薯根腐病菌（Fusarium solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum） 均由本实验室分离保存；供试土样及植物组织采自山东农业大学南校区植物保护学院试验站；供试苦瓜品种为如玉41号，由福建省农业科学院张玉灿研究员提供。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于培养真菌；木霉选择性培养基（THSM）（K2HPO4 0.90 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、NH4NO3 1 g、KCl 0.15 g、葡萄糖3 g、孟加拉红0.15 g、琼脂15 g、蒸馏水定容至1 000 mL，灭菌后，添加氯霉素0.25 g、链霉素0.03 g 和五氯硝基苯0.2 g）用于从土壤中分离纯化木霉；马铃薯葡萄糖（PDB）液体培养基用于木霉和病原菌液体培养。

1.2 木霉菌株的分离纯化

从蔬菜田中采集苦瓜植株及根际土，植株经表面消毒后切成0.8 cm小段接种到PDA培养基上，待长出木霉菌落后挑菌丝接种到新的PDA培养基上进行纯化；根际土采用稀释涂布平板法：取10 g根际土加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中于150 r/min摇床上振荡30 min，从锥形瓶中吸取1 mL混合均匀的土壤悬浊液，用无菌水进行梯度稀释，分别从10-3、10-4、10-5三个梯度中吸取200 μL加到THSM培养基平板上涂布均匀，将平板放于25℃条件下培养3 d，后挑取木霉单菌落转接到PDA培养基上进行纯化。

1.3 拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌筛选及室内防治效果测定

将苦瓜枯萎病菌接种到PDA培养基上，25℃条件下培养7 d。将纯化的木霉菌株接种到PDA培养基上，25℃培养72 h。分别取两者的菌饼，两点对峙培养法接种到新的PDA培养基上，以单独接种苦瓜枯萎病病原菌的平板作为对照，7 d后测病原菌菌落半径并计算抑制率。抑制率（%）=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100。

将平板对峙效果较好的木霉菌株接种到PDA培养基上，25℃培养至产孢，用无菌水冲洗收集孢子后制备成1.0×108 cfu/mL的孢子悬浮液作为生防菌剂备用。尖孢镰刀菌等供试病原菌株菌饼接种到PDB液体培养基中，在180 r/min振荡培养5 d，过滤菌丝后制备成1.0×106 cfu/mL孢悬液，按基质∶孢悬液=10∶1的比例混匀。将苦瓜苗栽种到基质中，同时以不同木霉生防菌剂作为处理，每株苗加20 mL制备好的相同浓度的木霉孢子悬浮液，对照组加等量无菌水，每处理31株苗。30 d后调查各处理的发病率和病情指数，计算防病效果。病害分级标准[6]：0级，无病症；1级，子叶发黄；3级，子叶变黄且边缘皱缩，真叶正常；5级，子叶皱缩枯死，部分真叶发黄；7级，真叶发黄，部分叶片黄化或停止生长；9级，全株叶片黄化萎蔫或枯死。病情指数=Σ（各级病株数×该级代表值）/（总株数×最高级代表值）×100。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 形态学鉴定 将平板对峙效果较好的木霉菌株（M2和MX）进行分离纯化培养5 d后，转接到PDA平板上，25℃分别培养3、6 d后观察菌落形态、测量菌落直径并记录菌落形状及颜色变化；用显微镜观察分生孢子梗及分生孢子形态。

1.4.2 分子生物学鉴定 采用TIANGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取平板对峙效果较好的木霉基因组DNA，分别利用由铂尚生物技术（上海）有限公司合成的ITS通用引物对（ITS5和ITS4）[7]、rpb2引物对（fRPB2-5f和fRPB2-7cr）[8]和tef1-α引物对（EF1728F和TEF1LLErev）[9]进行PCR扩增。

PCR反应体系为25 μL：PremixTaq 12.5 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1 μL。PCR扩增条件：ITS引物为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。rpb2引物为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，59℃退火90 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。tef1-α引物为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55℃退火90 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。回收PCR产物，PCR产物由铂尚生物科技（上海）有限公司完成碱基序列测定。将三段序列分别进行多重序列比对并剪切掉首尾未对齐的碱基片段后线性串联拼接，从GeneBank中下载合适的木霉菌株序列进行相同处理，同源性比较分析后，利用MEGA 5.0和MrBayes软件进行多基因联合系统发育分析。

1.5 木霉菌定殖能力的检测

分别根据木霉菌的tef1-α及rpb2序列片段，通过IDT荧光定量PCR引物在线设计网站（http：//sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/Default.aspx）设计特异性引物，通过和NCBI中与目标木霉菌株相似性高的木霉菌株相应序列BLAST比对，并通过从土壤中分离收集的10株木霉菌片段扩增验证，筛选目标菌株的荧光定量PCR特异性引物对，得到的引物对为：绿木霉M2（TEF1-2-F：5′-AGTACGCTTGGGTTCTTGAC-3′；TEF1-2-R：5′-TCCTGGTTAGCACTGGTTTG-3′）；棘孢木霉MX（RPB2-X-F：5′-CTGGTGCGGTGGAATATCTC-3′，RPB2-X-R ：5′-TCGGATTTGTCTTGGTCTTGAG-3′）。用特異性引物扩增出目的菌株的特异性片段后，使用凝胶回收试剂盒对片段进行回收纯化并测序检测。纯化后的片段用pGEM-T Easy Vector进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、验证后用质粒小提试剂盒进行质粒提取，得到高纯度重组质粒。重组质粒重新送交测序鉴定，鉴定完毕后，用紫外分光光度计测定其OD260值和OD280值，测其纯度（1.8

拷贝数=质粒浓度（ng/μL）×质粒体积（μL）×6.02×1023（copies/mol）/{660（g/mol）×[载体长度（bp）+片段长度（bp）]}

将定量的质粒按照拷贝数进行10 倍梯度稀释，稀释8个梯度作为qPCR标准品。

将苦瓜苗栽种到温室中，栽苗时分别在根部加5 mL M2、MX木霉孢子悬浮液（浓度为1.0×109 cfu/mL）作为处理，每处理31株苗。分别在移栽0、7、14、21、28、35、42、49 d从各处理随机取苗3株，将根际土、根、茎、叶样本分装后-80℃保存。分别用土壤样本总DNA提取试剂盒及植物基因组DNA提取试剂盒提取各样本DNA，将其稀释至相同濃度后置于-20℃保存。

实时荧光定量PCR反应体系应用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒进行扩增。反应体系为20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.6 μL，100 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O补足至20 μL。使用罗氏LC96荧光定量PCR仪进行扩增，扩增条件为：95℃ 15 min；95℃ 10 s，57℃ 20 s，72℃ 25 s，循环40次；熔解曲线分析条件为95℃ 10 s，60℃ 60 s，97℃ 1 s，每0.2℃收集荧光信号1 s。

2 结果与分析

2.1 生防木霉的筛选及室内拮抗苦瓜枯萎病菌的效果

将筛选得到的13株木霉菌株进行平板对峙培养和室内拮抗试验，得出两株拮抗活性较好的木霉菌株M2、MX，对苦瓜枯萎病菌的平皿抑菌率分别为68.03%、76.29%。由表1可知，木霉菌株M2、MX的盆栽防效分别为54.63%、45.72%。

除尖孢镰刀菌外，两株木霉对多种病原菌均有较好的抑制作用，表现出广谱的拮抗活性，在测试的病原菌中，两株木霉对苦瓜枯萎病菌、玉米纹枯病菌抑制效果最好，对杨树水泡溃疡病菌、苹果霉心病菌、核桃炭疽病菌和苹果树腐烂病菌的抑制效果次之，对甘薯根腐病菌、黄瓜褐斑病菌抑制效果较差。MX菌株对番茄灰霉病菌抑制效果显著优于M2菌株，但对小麦赤霉病菌的抑制效果低于M2菌株（表2）。

2.2 形态学鉴定结果

木霉菌株M2在PDA培养基上生长较快，3 d可长满整个平板，气生菌丝浓密，大量的产孢簇形成绿色的同心轮纹；分生孢子梗呈半透明，向顶分枝不规则，每个分枝最顶端有3～6个紧密贴在一起的瓶梗，靠基部部分为紧贴在一起的分枝，分枝直角生出或向顶呈反射状；瓶梗为坛形至安瓿形，基部缢缩，中部膨大，逐渐向顶变细，顶端着生分生孢子；分生孢子阔椭圆形，墨绿色。初步形态鉴定M2菌株为绿木霉。

MX菌株在PDA培养基上生长较快，4 d左右长满整个平板，紧贴培养基表面产生短绒毛状气生菌丝；产孢簇离散分布于平板表面，初期白色，后期变绿；菌落有特殊芳香气味；分生孢子梗顶端具两个或多个瓶梗，瓶梗较直，安瓿形，中部稍微加粗，基部稍有缢缩，分生孢子球形至卵圆形，墨绿色。初步形态鉴定MX菌株为棘孢木霉。

2.3 分子生物学鉴定结果

运用三对通用引物分别扩增出两株木霉的ITS、tef1、rpb2基因序列，菌株M2的三段序列长度分别为577、581、954 bp，菌株MX的三段序列长度分别为512、587、1 094 bp。将两株木霉的序列分别与下载的木霉菌株序列进行同源性比较，并构建联合系统发育树。

木霉菌株M2聚类到了Trichoderma virens进化枝上，MX菌株聚类到了Trichoderma asperellum进化枝上（图1）。分子生物学鉴定的结果和形态学鉴定结果一致，M2菌株为绿木霉（Trichoderma virens），MX菌株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

2.4 木霉定殖能力的检测

2.4.1 qPCR引物特异性分析 M2菌株的特异性片段长度181 bp，MX菌株的特异性片段长度150 bp。通过10倍梯度稀释的重组质粒标准品的qPCR反应绘制标准曲线，选取线性关系最好的4个梯度制备曲线。以模板起始浓度的对数值为横坐标，以各浓度梯度的模板反应循环阈值（Ct值）为纵坐标绘制标准曲线。M2菌株的标准曲线斜率为-3.3427，相关系数为1.00，扩增效率为199%，回归方程为Ct=-3.3427lg（copy number）+36.17；MX菌株的标准曲线斜率为-3.2087，相关系数1.00，扩增效率205%，回归方程Ct=-3.2087lg（copy number）+36.24。由图2分析可知，在60～98℃区间内，两曲线均仅有一个特异性峰，引物特异性良好。

2.4.2 M2、MX在苦瓜苗组织内的定殖能力 木霉M2菌株在苦瓜根部有少量定殖，最高定殖量在7 d的样本中检测到，为2 365 copies/μL；在茎和叶组织中不能稳定定殖，检测到的定殖量均低于100 copies/μL。MX菌株在根、茎、叶组织中均不能稳定定殖，检测到的定殖量均低于100 copies/μL（图3）。

2.4.3 M2、MX在土壤中的定殖能力 两株木霉在土壤中均能够稳定定殖，在向土壤中施加木霉菌剂后1～2周，定殖量略有降低，随后两株木霉在土壤中稳定定殖，检测到的定殖量也随时间逐渐增加，M2菌株49 d取样检测到的定殖量较0 d时提高1.08倍，MX菌株则提高1.49倍（图4）。

3 讨论与结论

木霉菌具有竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性和协同拮抗作用等多重生防机制[11]，是一类防治范围广、效果显著的生防菌。目前已报道木霉对作物的根腐病、冠腐病、茎腐病、赤霉病、枯萎病等尖孢镰刀菌病害有很好的防效[12-15]，本研究筛选的绿木霉M2菌株和棘孢木霉MX菌株也表现出防病效果好、防病谱广的特点，对苦瓜枯萎病的防效分别为54.63%和45.72%。良好的定殖能力是木霉发挥防病效果的前提[16-18]，张红骥等[19]研究发现木霉菌在大豆根系的定殖能力与其防病效果有着紧密的联系，赵兴丽等[20]研究发现钩状木霉可以在辣椒根际定殖并发挥防病促生的作用。常规的稀释涂布平板法不能很好地监测木霉菌在植物组织及土壤中的定殖情况，实时荧光定量PCR技术通过检测木霉菌目标片段PCR扩增产物的荧光强度来检测环境样本中目标木霉的种群量[12]，本研究应用此技术对两株木霉在49 d周期内植物组织及土壤中的定殖能力进行了监测，结果显示，木霉菌株M2、MX在苦瓜植株的根、茎、叶部定殖能力均较差，在土壤中则能稳定定殖，且在随后的取样周期内检测到的种群量逐渐增多，这与Montealegre等[21]研究的哈茨木霉防治土壤立枯丝核菌时的定殖趋势一致，土壤中木霉的菌落数随着时间延长而增加。贺字典等[22]应用qPCR技术检测棘孢木霉在土壤中的定殖量时，42 d后定殖量才开始增长，本研究中木霉菌株M2、MX在14 d后定殖量即开始增长，这说明它们能更快速地在土壤中稳定定殖，保护植物根系抵御病原菌的侵染。

综上，绿木霉M2和棘孢木霉MX菌株对苦瓜枯萎病有较好的防病效果，且在土壤中有良好的定殖能力，能快速在土壤中稳定定殖发挥生防作用，具有较大的应用潜力。

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