樊庆琦 黄承彦 解树斌 隋新霞 崔德周 李永波 楚秀生

摘要：

小麥叶绿素含量与产量密切相关，而SPAD值与叶绿素含量呈显著正相关。本文以保存的189份山东省小麦种质资源为研究对象，测定缺铁胁迫下小麦苗期叶片的SPAD值，并进行全基因组关联分析（GWAS）。结果表明，正常培养条件下，SPAD值均值为39.18，变幅为28.33～48.19；缺铁胁迫条件下，SPAD值均值为3.56，变幅为0.07～12.87；胁迫指数均值为-90.89，变幅为-99.83～-68.06，品种间存在极显著差异。利用可变类平均法进行系统聚类，欧式距离为10时，可划分为5大类群。根据不同类群缺铁胁迫SPAD值和胁迫指数的变化特点，供试小麦材料可分为铁耐受型、中间型和敏感型。全基因组关联分析结果显示，在正常处理下，检测到与SPAD值显著关联的SNPs位点23个，分布于1A、2A、2D、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5D、6A、6B、6D和7B等染色体上，其中在3B染色体上检测到4个显著的SNPs位点，可能存在与叶绿素含量相关的基因。对于铁耐受型小麦材料的利用，有助于小麦产量和适应性相关性状的遗传改良；对关联SNPs位点的深入研究，有利于深入了解铁与小麦叶绿素合成和调控的遗传机制。

关键词：小麦；缺铁胁迫；SPAD值；全基因组关联分析

中图分类号：S512.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0012-07

Effects of Iron Deficiency Stress on Chlorophyll Content and

GWAS Analysis of SPAD Value in Wheat Seedling Stage

Fan Qingqi1， Huang Chengyan1， Xie Shubin2， Sui Xinxia1， Cui Dezhou1， Li Yongbo1，Chu Xiusheng1

（1. Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley，

Ministry of Agriculture/National Engineering Laboratory for Wheat & Maize， Jinan 250100， China；

2. Shandong Luyan Agricultural Seeds Co.， Ltd.， Jinan 250100， China）

Abstract The content of chlorophyll in wheat is closely related to yield， while soil plant analyatical development （SPAD） value is positively correlated with chlorophyll content. In this research， 189 wheat germplasms from Shandong Province were selected as the research objects， the SPAD value of leaf blade at seedling stage was determined and the genome-wide association analysis （GWAS） was also carried out. The results showed that under normal culture treatment， the SPAD value ranged from 28.33 to 48.19 with a mean value of 39.18. Under iron deficiency treatment， the SPAD value ranged from 0.07 to 12.87 with a mean value of 3.56. The stress index （SI） ranged from -99.83 to -68.06 with a mean value of -90.89. There were significant differences in the tested materials. All the tested materials were divided into five groups using variable class average systematic clustering when the Euclidean distance was 10. And they also could be divided into resistant type， middle type and sensitive type based on the characters of SPAD value in different groups. GWAS showed that total 23 single nucleotide polymophisms （SNPs） associated with SPAD value distributed on the wheat chromosomes 1A， 2A， 2D， 3A， 3B， 4A， 4B， 4D， 5A， 5D， 6A， 6B， 6D and 7B， respectively. Four SNPs which were located on chromosome 3B might be related to chlorophyll content. The utilization of iron tolerant wheat germplasms could help to improve the genetic improvement of wheat yield and adaptability， and in-depth study on the correlation SNPs site would be helpful to understand the genetic mechanism of the synthesis and regulation of chlorophyll.

Keywords Wheat； Iron deficiency stress； SPAD value； GWAS

叶绿素作为光合作用的物质基础，可将光能转化为化学能，对植物的生长发育至关重要。在小麦等作物中，籽粒产量的70%～90%来自于光合作用[1，2]。小麦中的叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b，其含量直接影响光合效率[3，4]。日本农林水产省开发的SPAD便携式叶绿素测定仪，基于650 nm和940 nm光学浓度差的原理，测定植物叶片叶绿素相对含量。SPAD值与叶绿素含量呈乘幂关系，相关系数为0.94[5]，与叶绿素含量呈显著正相关，为叶绿素含量的测定提供了简捷、快速的工具，广泛应用于小麦等作物SPAD值与产量、品质和氮素营养方面的研究[6-12]。

叶绿素含量与植物的营养状况密切相关。铁虽然不是叶绿素的组分，但却参与叶绿素的合成。植物体内80%的铁存在于叶绿体内，铁含量与叶绿素含量呈现良好的正相关。铁影响叶绿体的构造，而叶绿体则是叶绿素合成的先决条件[13]。

植物缺铁时，细胞中叶绿素合成数量和质量均明显下降，叶绿体变小，外表不清晰，片层系统无法垛叠形成基粒。缺铁严重时，可导致细胞膜变薄、细胞壁疏松、膜囊系统破坏，胞内细胞器如类囊体、叶绿体解体或液泡化，高尔基体膨胀等[14-17]。植物缺铁常常出现新叶黄化失绿现象，严重时整株叶片呈黄绿色，并出现一些小型干枯斑点，幼叶叶脉间形成缺绿条纹或整片叶发白，主叶不出，不能抽穗，老叶则常早枯[18]，植株生长迟缓，严重影响植物的正常生长发育。

随着QTL定位及全基因组关联分析在小麦中的广泛应用，开展小麦叶绿素相关基因的研究，对提高小麦产量潜力具有重要意义。Czyczyo-Mysza等[19]对叶绿素荧光特性进行了QTL定位研究，发现116个QTL位于除7B染色体以外的染色体上。总体而言，目前关于此类研究仍相对较少。

山东省是我国小麦主产区，常年播种面积366.67×104 hm2，面积约占全国的1/7，但总产却占到了全国的1/6～1/5。山东省农业科学院作物研究所保存了自20世纪50年代以来的小麦地方品种、审定品种和其它种质资源，是重要的小麦基因库[20]。然而，对于这些保存的小麦种质资源缺铁胁迫下叶绿素含量的遗传演变研究以及全基因组关联分析，至今仍未开展。本试验以保存的山东省小麦地方品种、审定品种和其它种质资源为研究对象，利用SPAD叶绿素测定仪，考察苗期缺铁胁迫下叶绿素含量在品种间的差异和变化规律，为小麦种质资源的评价和创新利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小麦试验材料189份，包括地方品种、审定品种和其它种质资源，其中，地方品种27份，20世纪50年代育成品种10份，60年代育成品种4份，70年代育成品种8份，80年代育成品种12份，90年代育成品种15份，21世纪初育成品种46份，2010年后育成品种18份，其它种质资源49份（表1）。

1.2 营养液培养及数据采集

挑选每份材料籽粒饱满的种子10粒，3次重复。种子经1.5%次氯酸钠消毒5 min后，腹沟朝下，均匀摆放至珍珠棉和纱网缝制的发芽盘内，然后将其放入盛有1 L超纯水的培养盒（15 mm×15 mm×20 mm）中，在人工智能温室中发芽，光周期为光照16 h/黑暗8 h，光强12 000 lx，温度25℃，3天换水1次。

种子发芽7天后，仔细将种子从幼苗根部去除，加入培养液进行培养。其中，对照处理营养液配方为：0.7 mmol/L K2SO4，0.1 mmol/L KCl，2 mmol/L Ca（NO3）2 ，0.5 mmol/L MgSO4，0.1 mmol/L KH2PO4，1 μmol/L H3BO4，0.5 μmol/L MnSO4，0.2 μmol/L CuSO4，0.5 μmol/L ZnSO4，0.01 μmol/L （NH4）6Mo7O24，100 μmol/L FeEDTA。缺铁胁迫营养液配方除无FeEDTA外，其余如对照处理。营养液3天换1次，小麦培养至三叶一心时，利用SPAD-502叶绿素仪测定倒三叶中部，重复3次，重复间SPAD值相差不超过0.5。

根据正常和缺铁培养条件下的SPAD值计算胁迫指數，公式如下：

SI=XFe--XFe+XFe+×100% 。

式中，SI为胁迫指数；XFe-为材料缺铁胁迫培养的SPAD值；XFe+为材料正常培养的SPAD值。

1.3 660K芯片的SNP检测

每份供试小麦材料取5粒种子混合，送至北京康普森生物技术有限公司进行Affymetrix wheat 660K芯片检测。

1.4 数据分析

利用Microsoft Excel 2016进行SPAD值的数据计算和图表制作；利用DPS 10.65高级版进行方差分析和聚类分析。660K SNP芯片使用Affymetrix的软件APT1.17.0和SNPolisher 1.5.0进行分型，剔除分型成功率小于90%的SNP位点，质控后的数据采用TASSEL软件的线性模型（GLM）进行正常和缺铁胁迫下的SPAD值以及胁迫指数的GWAS分析，以Bonferroni校正显著性阈值（P值）。

P=0.05/质控后的SNP数目

低于此阈值的SNPs，认为与表型显著关联。

2 结果与分析

2.1 不同处理SPAD值及胁迫指数的方差分析

在正常处理条件下，供试小麦材料的SPAD值均值为39.18，方差为13.53，变异系数为27.18%，材料间呈极显著差异；缺铁胁迫条件下，SPAD值仅为3.56，远低于正常值，方差为6.42，变异系数为39.48%，材料间也呈极显著差异。就胁迫指数而言，所有材料均表现为负值，均值为-90.89，方差为40.80，变异系数为15.66%，材料间亦存在极显著差异（表2）。由此可知，一方面，供试小麦材料在正常营养供应条件下，品种间的叶绿素含量存在极显著差异；另一方面，缺铁胁迫严重阻碍了叶绿素的合成，SPAD值显著下降，变异系数显著增加，表明缺铁胁迫下不同品种叶绿素含量差异更大。此外，胁迫指数也存在品种间的差异，但变异幅度较前两者小。

2.2 SPAD值的聚类分析

根据胁迫指数，利用可变类平均法对189份小麦试验材料进行系统聚类分析，当欧式距离为10时，供试材料可分为5大类群（图1）。每个类群在不同处理下的SPAD值及胁迫指数的平均值见表3。

第1类群包含碧玛1号、济南13、汶农5号等41个品种，占供试小麦材料的21.69%。该类群正常条件下SPAD值的平均值为35.11，缺铁胁迫条件下平均值为2.39。

第2类群包含钱交麦、鲁麦1号、鲁麦20、莱州137、济南18等24个品种，占供试小麦材料的12.70%。正常和胁迫处理下，SPAD值的平均值分别为35.42和5.31。

第3类群包含泰山1号、鲁麦14、烟农15、济麦22等62个品种，占供试小麦材料的32.80%。正常和胁迫处理下，SPAD值的平均值分别为41.87和3.67。

第4类群包含济南8号、济南16、莱州953等41个品种，占供试小麦材料的21.69%。

正常和胁迫处理下，SPAD值的平均值分别为40.10和0.93。

第5类群包含山农664、山农21、山农22、山农24等21个品种，占供试小麦材料的11.11%。正常和胁迫处理下，SPAD值的平均值分别为41.63和8.69。

这5大类群SPAD值平均值的大小顺序，正常处理下为3>5>4>2>1，缺铁胁迫处理下为5>2>3>1>4；胁迫指数的大小顺序为5>2>3>1>4。综合分析，第5和第2类群在缺铁胁迫下SPAD值和胁迫指数均相对较高，表明在缺铁条件下，这两个类群的小麦品种仍具有叶绿素合成的能力，为缺铁耐受型品种。第4类群的小麦品种虽然正常处理下SPAD值表现较高，但在缺铁胁迫下，SPAD值接近零，表现为在缺铁条件下基本不具备合成叶绿素的能力，为缺铁敏感型品种。第1类和第3类群则属于中间类型。

2.3 不同反应类型小麦品种的演变

依据上述分析划分的对缺铁胁迫的反应类型，统计各来源小麦品种的类型分布，结果见表4。可以看出，小麦地方品种、20世纪50年代以及70年代的品种以中间类型为主；80年代和90年代耐受型品种的比例增加明显，分别为41.67%和46.67%，但80年代仍主要以中间型品种为主；进入21世纪后，耐受型品种的比例又有所下降，分别为28.26%和22.22%，以中间型品种为主，占比均超过50%。

2.4 SPAD值的GWAS分析

189份小麦样品的SNP数据，剔除分型成功率小于90%的染色体位点34 472个，剔除较小等位基因频率小于0.05的染色体位点176 659个，质控后的SNP数目为419 383个，以Bonferroni校正的5%基因组水平显著的P值阈值为1.1922×10-7（0.05/419383）。低于该阈值则认为与表型显著关联。正常和缺铁胁迫条件下的manhattan图和QQ-plot图见图2。

根据结果，缺铁胁迫下的SPAD值和胁迫指数均未检测到显著SNPs，正常培养条件下，检测到23个显著SNPs。

统计显著SNPs在染色体的位置，发现有20个分布在1A、2A、2D、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5D、6A、6B、6D和7B染色体，另3个SNPs在染色体上的位置未知。其中，在3B染色体上发现4个显著SNPs，该染色体可能存在与叶绿素合成有关的基因。可见，与叶绿素合成或调控有关的基因广泛分布于小麦染色体组。

3 讨论

SPAD值不仅与叶绿素含量具有良好的显著正相关关系[5]，还与小麦氮素养分高效密切相关[7，9，10]。由于叶绿素含量与产量及产量构成因素也呈显著正相关关系[21]，因此，可以通过SPAD值获得的小麦生长发育过程中的叶绿素含量信息，进一步评估小麦的营养发育状况。

根据本研究结果，供试小麦材料在缺铁胁迫下，SPAD值严重下降，有的甚至接近零，表明铁元素作为叶绿素合成的必需元素，其营养状态对叶绿素的合成和小麦的正常生长发育至关重要。

无论在正常情况下还是缺铁胁迫下，SPAD值存在品种间的差异，这种差异可能是基于基因型的差异所导致。根据系统聚类，第2类群和第5类群的SPAD值在正常和胁迫处理条件下均较高，表明这两类群中的小麦品种具有较好的缺铁耐受能力。从品种的演变来看， 20世纪80、90年代，耐受型小麦品种的比例大幅增加，而敏感型品种的比例显著下降，表明这段时期选育的小麦品种较耐缺铁胁迫，叶绿素合成能力较强。处于第5类群的现代小麦品种，如山农22、菏麦19等，SPAD值在正常培养条件下分别达到40.29和45.22，在缺铁胁迫下分别为12.87和9.79，说明其缺铁耐受能力较强，在缺铁胁迫下仍能维持部分叶绿素合成；且这些品种农艺性状优良，产量水平较高，可以作为重要的骨干亲本加以利用。

SPAD值全基因组关联分析结果显示，与之关联的显著SNPs广泛存在于小麦基因组中，且有4个显著SNPs位于3B染色体，可能该染色体上存在叶绿素合成相关基因。本研究结果与Czyczyo-Mysza等[19]对叶绿素荧光特性的研究结果一致，表明叶绿素的合成具有复杂的遗传机制，是众多基因参与的结果。

在下一步的研究中，首先，将利用缺铁胁迫条件下SPAD值表现较高的现代小麦品种，培育叶绿素含量高、对缺铁耐受力强的小麦新品种；其次，利用本研究发现的SNPs位點进行有关分子机理研究，验证上述SNPs在小麦体内的时空表达以及贡献率。

4 结论

无论是在正常培养还是缺铁胁迫条件下，小麦苗期SPAD值均存在品种间差异。正常条件下，SPAD值均值为39.18，变幅为28.33～48.19；缺铁胁迫条件下，均值为3.56，变幅为0.07～12.87；胁迫指数均值为-90.89，变幅为-99.83～-68.06，品种间均存在极显著差异。利用可变类平均法进行系统聚类，欧式距离为10时，供试小麦材料可划分为5大类群，第5类群在2种处理下SPAD值均表现较高。通过全基因组关联分析，在正常培养条件下检测到23个显著SNPs，分布于14对染色体，其中在3B染色体上检测到4个显著SNPs。

致谢：感谢贾继增和高丽锋研究员无偿提供76份小麦试验材料的SNPs数据。

参 考 文 献：

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