韩小东 张荣志 宋国琦 李玮 李玉莲 张淑娟 高洁 陈明丽 李根英

摘要：小麦抗赤霉病基因中，Fhb1基因的抗性最强且最稳定。为了解620份小麦品种（系）Fhb1区段内PFT（pore-forming toxin-like）基因不同等位变异的情况及其地理分布规律，我们采用基因扩增和KASP基因分型技术对其进行了鉴定。检测结果表明，在这些小麦品种中，共存在3种基因型，即PFT-Ⅰ基因型（GT）、PFT-Ⅱ基因型（AC）和PFT-Ⅲ基因型（null），其频率分别为10.65%、14.19%和75.16%，即只有約四分之一的小麦品种携带PFT基因。PFT-Ⅰ基因型主要分布在国内地方品种以及陕西、江苏和山东等地的育成品种中；而PFT-Ⅱ基因型则主要分布在河北、河南和山东等地的育成品种中。PFT-Ⅰ是小麦抗赤霉病的必需基因型。因此，这些含PFT-Ⅰ基因型的小麦品种（系）可作为小麦抗赤霉病品种选育的基础材料。

关键词：小麦；赤霉病；Fhb1；PFT；KASP标记

中图分类号：S512.103.53 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0001-06

Allelic Variation Distribution of Fusarium Head Blight Resistance

Gene Fhb1 in Wheat Germplasm

Han Xiaodong， Zhang Rongzhi， Song Guoqi， Li Wei，

Li Yulian， Zhang Shujuan， Gao Jie， Chen Mingli， Li Genying

（Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley， Ministry of Agriculture/

National Engineering Laboratory for Wheat & Maize， Jinan 250100， China）

Abstract The QTL Fhb1 conferring stable Fusarium head blight（FHB） resistance contributes to the largest effect in wheat. To characterize the allelic variation and geographic distribution of PFT（pore-forming toxin-like） gene in the Fhb1 region of 620 wheat cultivars （lines）， we identified it by PCR amplification and KASP （Kompetitive Allele Specific PCR）. The results showed that there were three genotypes in these wheat varieties， including PFT-Ⅰ（GT）， PFT-Ⅱ（AC）and PFT-Ⅲ（null） genotypes with the frequency of 10.65%， 14.19% and 75.16%， respectively. That was， only about quarter of the tested cultivars carried the PFT gene. Most of the wheat varieties with PFT-Ⅰ genotype were derived from the landraces and breeding cultivars from Shaanxi， Jiangsu and Shandong Province， while the varieties with PFT-Ⅱ genotype were mostly derived from the breeding cultivars of Hebei， Henan and Shandong Province. The PFT-Ⅰ genotype was essential for the FHB resistance in wheat. Thus， these wheat cultivars （lines） with PFT-Ⅰ genotype could be used as the basic materials for wheat breeding with FHB resistance.

Keywords Wheat； Fusarium head blight； Fhb1； PFT； KASP marker

赤霉病严重降低小麦产量、影响谷粒品质，其产生的毒素危及人畜、影响食品安全等[1-3]。近几年来，我国小麦赤霉病的发生区域有由长江中下游麦区和东北麦区向黄淮海麦区和北方麦区逐渐扩大的趋势[4]。小麦赤霉病抗性分为抗初次侵染（Type Ⅰ）、抗扩展（Type Ⅱ）、抗赤霉素积累（Type Ⅲ）、抗籽粒侵染（Type Ⅳ）和抗减产（Type Ⅴ）五大类[5]。每一种抗性类型均受表型加性效应和数量性状遗传的多基因调控[6]。Type Ⅱ型较其他类型稳定也易于鉴定[7]，从而成为研究最多的一种类型。

迄今为止，苏麦3号是赤霉病抗性最强最稳定的抗原之一[8]。在小麦抗赤霉病扩展基因中，3BS染色体上的主效QTL Fhb1基因的抗性最强且最稳定[9-15]。Rawat等[16]通过苏麦3号3BS染色体上的主效QTL Fhb1的精细定位，图位克隆获得了抗赤霉病扩展的基因PFT（pore-forming toxin-like）。PFT基因序列包含3 472个碱基，2个外显子和1个内含子。其编码区含1 437个碱基，编码478个氨基酸，属于嵌合凝集素类型蛋白。功能上可能与赤霉菌结合，抑制其生长，从而实现抗病。朱展望等[17]对229份小麦品种Fhb1区段内PFT、HC（HCBT-like defense response protein）和His基因的多样性与赤霉病抗性的关系进行了分析，发现整个PFT基因缺失的小麦材料，即为PFT-Ⅲ基因型（null），如中国春。在携带PFT基因的小麦品种中，有两个SNP位点的差异。第一个SNP（G/A）位点发生在第2 128位点，此位点的突变会造成mRNA的错误剪接。第二个SNP（T/C）位点，发生在第2 255位点。两个SNP位点为GT基因型的被命名为PFT-Ⅰ基因型，如苏麦3号。两个SNP位点为AC基因型的被命名为PFT-Ⅱ基因型，如南大2 419。而且只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ为抗赤霉病单倍型。

近几年来，KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）基因分型技术，因其成本低、通量高、精准度高和稳定性好等优点[18]，被广泛用于检测SNP分型及Indels位点[19，20]。前人对Fhb1区段内抗赤霉病基因的研究，主要通过分子标记进行常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，所研究的小麦品种（系）主要来源于赤霉病多发的长江中下游麦区[17]。本研究结合基因扩增和KASP基因分型技术，对620份不同来源（主要包括黄淮海麦区和北方冬麦区）的小麦品种（系）进行了抗赤霉病基因型的鉴定，以期为当地的小麦赤霉病抗性改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于PFT基因型鉴定的国内外小麦品种（系）共计620份，其中，国内品种（系）547份（含43份地方品种），国外品种（系）69份，来源不详4份。国内品种（系）包括北方冬麦区：北京33份，宁夏3份，河北38份，陕西34份和山西13份；长江中下游麦区：江苏9份；西南麦区：四川50份；黄淮海麦区：安徽19份，河南133份和山东165份；西北麦区：甘肃1份，新疆1份和青海4份；东北麦区：黑龙江1份。其中，江苏省的苏麦3号作为阳性对照。

1.2 试剂

2×TSINGKE Master Mix购置于青岛擎科梓熙生物技术有限公司；2×KASP Master Mix购置于LGC集团；DNA提取试剂盒购置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 小麦基因组DNA提取

每份试验材料取3粒种子，室温下发芽后取其幼嫩叶，参照植物基因组DNA提取试剂盒说明，提取其基因组DNA。利用NANODROP2000仪器检测DNA的浓度以及纯度，-20℃保存备用。

1.4 引物设计

依据苏麦3号主效QTL Fhb1区段（GenBank： KX907434.1）内PFT基因的序列，通过Primer Premier 5.0软件设计PFT基因的特异扩增引物（青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成）和KASP 标记引物（基因集团上海贝晶生物技术有限公司合成），见表1。

1.5 PFT基因的扩增

以上述提取获得的小麦基因组DNA为模板、PFT-F/PFT-R为引物进行PCR扩增，以筛选PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麦品种。PCR反应采用15 μL体系：2×TSINGKE Master Mix 7.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反应在Eppendorf系列PCR仪上进行，程序如下：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。取8 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测带型，以确定其基因型。

1.6 KASP反应

将用来鉴定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ变异类型的KASP引物进行混合，共有2组引物，每一组混合引物都由两条末端标签序列不同的等位基因正向引物（100 μmol·L-1）各12 μL、一条共同的反向引物（100 μmol·L-1）30 μL和46 μL ddH2O组成。PCR反应采用5 μL体系：2×KASP Master Mix 2.5 μL，混合引物0.07 μL，DNA（10 ng·μL-1）2.0 μL，ddH2O 0.43 μL。空白对照（NTC）的DNA模板用ddH2O代替。PCR程序如下：94℃热激活15 min；94℃变性20 s，61℃退火/延伸60 s，10个循环（每个循环降低0.7℃）；94℃变性20 s，55℃退火/延伸60 s，26个循环。反应结束后在酶标仪Pherastar上读取荧光数据，并通过SNPviewer软件生成基因分型图。

2 结果与分析

2.1 小麦基因组DNA提取

用NANODROP2000仪器检测出的DNA浓度均在500 ng·μL-1左右，A260/A280的OD值處于1.8～2.0之间。基因组DNA电泳结果如图1所示，所提DNA条带清晰无弥散，可用于下一步试验。

2.2 PFT基因的扩增

为了筛选出PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麦品种，根据PFT基因的序列设计特异引物，进行了普通PCR扩增。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的带型，结果如图2所示：目的条带为842 bp的为PFT-Ⅰ基因型或PFT-Ⅱ基因型；没有目的条带的为PFT-Ⅲ基因型。检测结果显示，466份小麦材料为PFT-Ⅲ，154份小麦材料为非PFT-Ⅲ。

2.3 小麦品种PFT基因型的KASP检测

利用KASP标记引物通过基因分型技术鉴定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ基因型的变异类型，结果如图3所示。图中每个圆点都代表着一个小麦品种，每组混合引物将154份小麦材料分为两组，红色圆点为HEX标签序列，蓝色圆点为FAM标签序列，黑色圆点为空白对照。图3A和图3B为第一个SNP位点（G/A）的分型结果，红色圆点代表PFT-Ⅱ基因型中的A∶A，有88份；蓝色圆点代表PFT-Ⅰ基因型中的G∶G，有66份。图3C和图3D为第二个SNP（T/C）位点的分型结果，红色圆点代表PFT-Ⅱ基因型中的C∶C，有88份；蓝色圆点代表PFT-Ⅰ基因型的T∶T，有66份。综合上述结果，PFT-Ⅰ基因型（GT型）的小麦品种共66份，PFT-Ⅱ基因型（AC型）的小麦品种共88份，未检测到基因型为GC型和AT型的小麦品种。因此，共有66份小麦品种可能具有赤霉病的抗性。

2.4 不同基因型小麦品种资源的区域分布

参与试验的620份小麦品种（系）中，通过PFT基因的PCR检测发现PFT-Ⅲ基因型分布最多，约占所选材料的四分之三，而PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ基因型的分布频率相当，分别为10.65%和14.19%（表2）。如图4所示，在地方品种（50%以上的为PFT-Ⅰ基因型）、北方冬麦区的陕西、长江中下游冬麦区的江苏和黄淮海冬麦区的山东和河北等地，含PFT-Ⅰ基因型的小麦品种（系）分布频率较高；含PFT-Ⅱ基因型的小麦品种（系）则主要分布于北方冬麦区的河北、黄淮海冬麦区的河南和山东等地。国外小麦品种（系）中，大部分属于PFT-Ⅲ基因型；日本品种（系）中，有2个属于PFT-Ⅰ基因型；法国品种（系）中，有1个属于PFT-Ⅰ基因型；意大利品种（系）中，有2个属于PFT-Ⅰ基因型。

本研究还利用中国作物种质资源信息网查询了部分已检测出的PFT-Ⅰ基因型小麦品种（系）的赤霉病抗性（表3），發现PFT-Ⅰ基因型小麦品种（系）中，21份材料表现为感赤霉病，2份材料表现为中感赤霉病，其余抗性未知。

3 讨论与结论

赤霉病表型鉴定受自然环境以及人的主观判断影响很大，不易被准确监测。KASP检测方法不仅上机试剂用量少、通量高，而且检测精确度很高。本研究通过基因扩增结合KASP标记准确又快速地鉴定出了620份小麦品种（系）（主要包括黄淮海麦区和北方冬麦区）中的PFT基因型。这为当地改良小麦赤霉病抗性育种过程中的亲本选配以及后期高代品系的初筛提供了参考。

620份小麦品种（系）的PFT基因型鉴定结果表明，PFT-Ⅲ类型为小麦品种（系）的主要基因型（分布频率为75.16%），这可能是与含有Fhb1区段的小麦品（种）系的农艺性状差和产量低等不符合现代育种家的要求等因素有关[17]。中国作物种质资源信息网公布的部分已检测出的PFT-Ⅰ基因型小麦品种（系）的赤霉病抗性发现，某些PFT-Ⅰ基因型小麦品种（系）感赤霉病；而朱展望等[17]对229份小麦品种（主要包括长江中下游麦区）Fhb1区段内PFT、HC和His基因的多样性与赤霉病抗性的关系进行了分析，其中PFT基因型分为PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ和PFT-Ⅲ三类，His基因型分为His-Ⅰ、His-Ⅱ和His-Ⅲ三类，但是只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ为抗赤霉病单倍型，这说明PFT-Ⅰ基因型虽然不能作为筛选抗赤霉病小麦品种（系）的最终标准，但可以作为初步筛选的方法。

本研究结果显示PFT-Ⅰ基因型主要分布在中国北方冬麦区的河北和陕西、长江中下游冬麦区的江苏、黄淮海冬麦区的山东以及国外的意大利和日本等地，而且50%以上的地方品种均为PFT-Ⅰ基因型。在国家农业科学数据共享中心作物科学数据分中心的小麦品种系谱数据库中，通过查询部分已检测出的PFT-Ⅰ基因型小麦品种（系）的系谱，发现PFT-Ⅰ基因型可能来源有三种，一种是地方品种，比如泾阳60、三月黄、洋小麦、白齐麦等；一种是苏麦3号或小偃6号的某一早代亲本，比如陕253（77-31/小偃6号//陕229）；最后一种为美国碧玉麦，比如石家庄54（蚂蚱麦/碧玉麦//早洋麦）、昌乐5号（济南4号变异株）、济南4号（蚂蚱麦/碧玉麦//早洋麦），因为本研究已检测蚂蚱麦和早洋麦属于PFT-Ⅲ基因型，而石家庄54为PFT-Ⅰ基因型，所以据此可推断PFT-Ⅰ基因型可能确实来源于美国的碧玉麦，这与前人的研究结果相一致[21-23]。此外，法国、日本和意大利的小麦品种中也检测到PFT-Ⅰ基因型的存在，预示PFT-Ⅰ基因型可能还有另外的来源。

总之，在今后的育种工作中，我们可以充分利用含PFT-Ⅰ基因型的小麦地方品种和栽培品种，从中选择农艺性状优良的作为亲本，来进行小麦抗赤霉病的品种改良和新种质资源的创制。

参 考 文 献：

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