许冠华 沈丽君 刘红胜 吴逢选 王云超⋆

恶性肿瘤已成为导致全球人口死亡的主要原因之一。化疗为肿瘤最常用的方法之一，但化疗缺乏特定靶向性，免疫功能抑制是其中一个重要的不良反应。而机体免疫功能对肿瘤的发生、发展及转归起重要作用［1］，免疫功能低下，可间接导致肿瘤的复发及远处转移，降低患者的生活质量和生存率。隐丹参酮为从丹参中提取的二萜醌类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、心血管保护、抑菌功效［2-3］，前期研究表明隐丹参酮具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用，同时具有增效顺铂、阿霉素抗实体肿瘤的作用［4-5］。2017年3月至8月作者通过实验研究探讨隐丹参酮对于荷瘤小鼠脾脏指数、T细胞增殖数量、T细胞亚群比例及对血清细胞因子IFN-γ、IL-2的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（批号：MUST-11081109）；顺铂购自德州德药有限公司（批号：130303）；胎牛血清购自Gibco公司（批号：10437-028）；0.25%胰蛋白酶购自HyClone公司（型号：SH30042.01）；ELISA试剂盒购自浙江宝成生物科技有限公司。

1.2 细胞与动物 PC9细胞由浙江省中医院中心实验室馈赠；4～6周龄SPF 级BALB/c小鼠由浙江中医药大学动物研究中心购自上海斯莱克公司，雌雄小鼠各20只，体重16～20g，全部小鼠适应性喂养7d，室温22～26℃，相对湿度40%～60%，明暗交替12h，自由饮水、采食。动物饲养室保持安静，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.3 仪器 CO2细胞培养箱，Thermo公司；超净工作台，苏州精华设备公司；多功能全波长酶标仪，Thermo公司；超低温冰箱，SANYO；流式细胞仪，BD公司；倒置显微镜，奥林巴斯公司；微量移液器，BD公司；低温冷冻离心机，Sigma 公司。

1.4 方法 （1）细胞培养：PC9细胞复苏后以2×106/ml密度接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，细胞在37℃，5%CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至80%～90%时用0.1%胰酶消化并按照1：3传代，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。选取对数生长期的PC9细胞用于实验。（2）荷瘤小鼠动物模型的建立与分组：接种PC9细胞前1d，剃去小鼠待接种区域（1cm×1cm）的毛。取对数生长期的PC9肺腺癌细胞，经胰酶消化后，用PBS 调整细胞浓度为1×106/ml，在小鼠右侧腋下接种肿瘤细胞0.1 ml（约合每只小鼠105细胞），接种完成后，当瘤块长至100mm3（接种后第7天左右）时，随机分为空白对照组、模型组、CPT组、DDP组及DDP联合用药组。（3）给药的剂量及方法：隐丹参组 100mg/（kg·d），DDP 组为 2mg/（kg·次），联合用药组 100mg/（kg·d）CPT+2mg/（kg·次）DDP，隐丹参酮连续给药15d，顺铂给药2次/周（每周第1、4天），正常小鼠作为对照组、模型组每日注射同体积的生理盐水，最后一次给药结束后行相关指标的检测工作。（4）检测相关实验指标：①隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠脾脏指数的影响：小鼠脱臼处死，以无菌操作取下脾脏，生理盐水冲洗，去除筋膜，用滤纸吸干残血后，电子天平称质量并计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）×10。②CCK8法检测隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠T 细胞增殖的影响：停止用药24h后处死小鼠，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，台盼蓝计数活细胞＞95%。用完全RPMI 1640培养液将脾细胞悬液调配成细胞浓度2×106/ml的单细胞悬液。取已制备的脾细胞悬液加入96孔培养板中，100μl/孔，每个样本做6个孔，37℃、5% CO2培养箱中培养72h。于实验终止前每孔加入CCK8试剂200μl，振荡器上振荡10min，酶标仪于570nm波长测定吸光度。细胞增殖率（%）=实验组平均吸光度/对照组平均吸光度×100%。③流式细胞术检测隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群的影响：取100μl已制备的脾淋巴细胞悬液于EP 管中，4℃、1000r/min离心5min，加入冷PBS 1ml，离心、弃上清液，加冷冻PBS 100μl，并按说明加入PE-Cy7-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD4、PE -抗小鼠CD8，4℃避光孵育30min，加入PBS 1ml，离心、弃上清液，加入500μl PBS，流式细胞仪检测。④ ELISA检测隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影响：末次给药后24h，小鼠球后静脉丛采血，每只取血0. 8～1 ml，分离血清。实验组均设5个复孔。将每个标准品及标本的吸光值减去空白孔的吸光值，绘制标准曲线，通过标本的吸光值在曲线上查出其对应浓度。IL-2/IFN-γ（μg/L）=标准曲线上查出的浓度× 稀释倍数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（）表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠脾脏指数的影响 见表1。

表1 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后脾脏重量、指数影响（）

表1 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后脾脏重量、指数影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与隐丹参酮组比较，ΔP＜0.01，与顺铂组比较，*P＜0.01

组别 n（只） 脾脏重量（mg） 脾脏指数模型组 8 74.69±6.51* 2.02±0.99*隐丹参酮组 8 89.60±9.04# 2.87±1.22#顺铂组 8 53.87±4.66#Δ 1.76±0.57#Δ联合用药组 8 84.52±7.39▲ 2.76±0.54▲对照组 8 118.77±10.04 3.66±1.54

3.2 隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠T细胞增殖的影响 见表2。

表2 隐丹参酮对荷瘤小鼠T细胞增殖的影响（）

表2 隐丹参酮对荷瘤小鼠T细胞增殖的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与顺铂组比较，ΔP＜0.05

组别 n（只） T细胞增殖率（%）模型组 8 74.76±10.54*隐丹参酮组 8 86.05±6.70#顺铂组 8 51.53±4.38#联合用药组 8 62.74±7.74Δ对照组 8 100.00

2.3 流式细胞术检测隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠T 细胞亚群的影响 见表3。

表3 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后T细胞亚群的影响（）

表3 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后T细胞亚群的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与顺铂组比较，ΔP＜0.05

组别 n(只) CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T CD4+/CD8+T NK细胞模型组 8 15.25±2.50* 13.02±0.99*12.02±0.99*1.12±0.99 1.38±0.99*隐丹参酮组 8 19.59±1.22#Δ 12.87±1.22 15.87±1.22#1.11±1.22 1.69±1.22#Δ顺铂组 8 11.48±0.57# 13.06±0.57 11.85±0.57 1.09±0.57 1.16±0.57#联合用药组 8 17.76±0.54Δ 12.76±0.54 12.01±0.54 1.10±0.54 1.54±0.54Δ对照组 8 26.54±4.26 18.52±1.54 17.66±1.54 1.16±1.54 1.98±1.54

2.4 ELISA 检测隐丹参酮对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2 的影响 见表4。

表4 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后IFN-γ、IL-2的影响（）

表4 隐丹参酮对荷瘤小鼠化疗后IFN-γ、IL-2的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与顺铂组比较，ΔP＜0.05；与隐丹参酮组比较，▲P＜0.01

组别 n(只) IFN-γ IL-2模型组 8 9.58±1.05* 1.65±0.53*隐丹参酮组 8 14.09±2.05#Δ 2.07±0.59#Δ顺铂组 8 6.49±0.83# 1.09±0.09#联合用药组 8 11.45±2.06Δ▲ 1.89±0.29Δ对照组 8 20.55±3.65 2.79±0.58

3 讨论

恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病，化疗是临床应用最广泛的治疗手段，化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也具有强大的抑制作用，对机体的免疫功能也具有全面抑制作用，使机体免疫功能低下。T 细胞介导的细胞免疫功能低下在肿瘤的发生发展中发挥着极其重要的作用，T 细胞的状况反映机体抗肿瘤的能力，而NK细胞是抗肿瘤的重要效应细胞，其不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，也可以通过产生IL-2、干扰素等增强其他细胞的抗肿瘤作用［6］。

隐丹参酮作为丹参酮类化合物中重要的组成成分之一，在抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病、抗缺血再灌注损伤及抗血小板聚集等方面显示出诸多药理活性［7］。前期研究发现隐丹参酮具有抗恶性肿瘤细胞、协同化疗药物抗恶性肿瘤细胞的作用，游艳等［8］研究表明：隐丹参酮可增强巨噬细胞吞噬功能及诱导巨噬细胞向M2 型分化，张雷等［9］研究表明隐丹参酮具有对正胶原性关节炎大鼠异常的免疫功能改善作用。

IFN-γ主要由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及造血细胞等产生，这些细胞受到病毒、细菌、内毒素、原虫等刺激产生IFN，临床上主要用于抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。而IL-2可促进活化B细胞增殖，为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。本实验研究表明，隐丹参酮具有增强荷瘤小鼠免疫功能的作用，主要机制与增强IFN-γ、IL-2的表达，进而促进T细胞亚群中CD3+、NK细胞表达，而NK细胞表达的增加与隐丹参酮抗肿瘤密切相关，CD3+表达的增强与肿瘤化疗预后密切相关。对于肿瘤患者而言，抗肿瘤及改善肿瘤患者免疫功能皆具有十分重要的作用，且两者可起到相互辅佐的作用，对于提高肿瘤患者生存周期、明显改善生活质量具有积极的作用。

本动物实验研究发现，模型组免疫功能受到明显的抑制，细胞毒药物的应用，使荷瘤小鼠的免疫功能更是雪上加霜，隐丹参酮为传统中草药丹参中的提取物，丹参素来有“一味丹参，功同四物”的神奇功效，应用隐丹参酮后，荷瘤小鼠的免疫功能明显改善，本实验某种程度上为丹参具有提高肿瘤患者免疫力的作用提供了依据。但是，本实验仅为单一次移值瘤动物模型，单一实验中心数据，仍需我团队科研人员对其他细胞株移值瘤动物模型或其他种群模型进行反复试验，为隐丹参酮服务于临床提供有效、足量的数据支撑。