曹志军，赵雪平，刘敏，赵亚利，李洵洲

(内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头，014109)

0 引 言

牛乳所含营养成分齐全，其中乳蛋白是乳中主要的营养成分，其组成较复杂。乳蛋白除了提供营养和具有许多生理功能外，还是遗传信息的携带者，因此研究乳蛋白的组成和含量对于评价乳的营养价值和加工特性以及指导遗传育种具有非常重要的意义。乳中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，酪蛋白主要由αs-CN、β-CN和κ-CN组成[1]，其含量及占总酪蛋白的比率影响乳的组成及乳的凝乳特性[2-3]；乳清蛋白主要由α-La和β-Lg等组成[4-5]，能够发生相互作用并且凝集[6]。乳蛋白具有遗传多态性，每种乳蛋白有一种或几种遗传性变异体[7]，奶牛胎次、哺乳动物种类、品种及动物的泌乳期和饲喂条件等因素影响乳中乳蛋白的含量。目前，乳蛋白分离和测定的方法有高效毛细管电泳[8]、双向凝胶电泳[9]和反相高效液相色谱法[10]，具有高分辨率和高灵敏度的液相色谱法（RP-HPLC）在分离和测定荷斯坦因奶牛[11]、瘤牛[12]、西门塔尔牛[13]以及其它杂交奶牛基因多态性与其产奶性能的研究中也得到了广泛应用。本文采用SDS-PAGE和RP-HPLC相结合方法分析不同胎次、乳房炎乳及病牛牛乳中的乳蛋白，了解其组成成分及含量分布，为比较分析不同胎次与病牛牛乳中乳蛋白的差异奠定基础，为牛乳的加工选择原料乳提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1220型高效液相色谱仪，M illpore超纯水系统，离心机，DYY—III型稳压稳流定时电泳仪。

丙烯酰胺，Tris-HCL，N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，十二烷基硫酸钠(SDS)，过硫酸铵(Ap)，四甲基乙二胺(TEM ED)，巯基乙醇，考马斯亮兰。

三氟乙酸(TFA)，乙腈，尿素，三羟甲基氨基甲烷(T ris碱)，柠檬酸钠和二硫苏糖醇（DTT）均为分析纯；实验用水均为M illpore超纯水；αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La和β-Lg标准品均购自sigm a公司。

1.2 方法

1.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳的测定

SDS-PAGE电泳采用质量分数的3%的浓缩胶和质量分数为12.5%的分离胶进行电泳测定[14]。

1.2.2 溶液制备

工作液A为165 mmoL/LT ris碱，8 mol/L尿素，5.37 mmol/L柠檬酸钠，19.5 mm ol/LDDT的混合溶液；工作液B为4.5m o l/L尿素-0.1%三氟乙酸(TFA)。

1.2.3 样品制备

（1）样品采集。牛奶样品均采自呼和浩特市犇腾牧业牛场。选取不同胎次健康荷斯坦奶牛50头，病牛乳和乳房炎乳各50头，每头采集50 m L奶样，各取500μL分装于离心管中。

（2）样品制备。各奶样中加入等体积的工作液A，样品混合后振荡10 s混匀，室温培养1 h。然后在4℃下以3 000 r/min离心10 min，除去表层乳脂，取一定体积下层清液，加入工作液B（1∶3体积比）稀释，混匀，过滤到进样瓶中待测。

1.2.4 标准品制备

准确称取各蛋白标准品，配制成10m g/m L溶液，后续操作如样品制备。

1.2.5 反相高效液相色谱条件

色谱柱：C 18柱（150 mm×4.6 mm,3.5μm）；流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为0.1%TFA乙腈溶液，经抽滤、超声脱气后备用；流速1 m L/min，柱温40℃，进样量10μL，检测波长214 nm；梯度洗脱程序：0～5 min，33～35%B；5～9 min，35～37%B；9～18 min，37～40%B；18～22 min，40～41%B；22～27.5 min，保持 41%B；27.5～28 min，41～43%B；28～36 min，43～45%B；36～45min，保持33%B[15]。

1.3 数据处理

将处理后的样品溶液进行液相色谱分析，每个样品重复3次，以保留时间定性，外标法定量。根据样品中出峰面积大小，计算出不同牛乳中主要蛋白质的百分含量[16]，计算结果见表1。采用SPSS（17.0）软件对试验结果进行统计分析。

表1 不同牛乳蛋白的百分含量 %

2 结果与讨论

2.1 不同种类牛乳蛋白质电泳分析

图1 不同胎次牛乳与病牛乳电泳图

采用SDS-PAGE的方法测定了不同胎次与病牛乳蛋白质主要组成及蛋白质的相对分子量，结果如图1所示。条带M为蛋白质标样，条带1、2和3为不同胎次牛乳脱脂乳电泳图，条带4和5未知病牛乳和乳房炎牛乳。从电泳图谱的负极(上)到正极(下)可以显示9种蛋白(亚基)组分，将其分为上(大分子量)、中(中分子量)和下(小分子量)三组：由图中可以看出，上端的大分子量组主要为乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)，第3胎牛乳中免疫球蛋白含量高于第1和第2胎牛乳，这与M oore[17]研究一致。乳房炎乳5与病牛乳4在这一区域条带较多，且条带明显下移，这一区域分子量范围在50～70 ku之间；中间的中分子量组为三种酪蛋白(αs-CN、β-CN和κ-CN)，酪蛋白含量高，分子量在20～40 ku之间，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差别不大。并且3个胎次牛乳下面有IgG轻链。病牛乳没有；下端的小分子量组主要包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，仅从分子量看，各胎次牛乳在此区间差别不大，α-La分子量大约为14 ku，β-Lg分子量大约为18 ku。乳房炎乳条带较多，各蛋白质分子量减小。分析图谱各牛乳差别的原因，可能是由于乳房炎乳与不同胎次乳由于其蛋白在一级结构上存在不同所致，因而造成蛋白质在高级结构、分子量及所带电荷的不同，最终体现在蛋白的迁移时间的不同。

2.2 不同种类乳蛋白质RP-HPLC分析

2.2.1 标品蛋白RP-HPLC分析

分别对5种标准样品进行蛋白色谱分析，结果见图2图3。在1.2.5色谱条件下，酪蛋白标样高效液相色谱图出峰蛋白依次为κ-CN、αs-CN和β-CN，出峰时间大约为6 min、16 min和21 min。乳清蛋白标样高效液相色谱图出峰蛋白依次为α-La和β-Lg，出峰时间为24 min和30 min。5种蛋白完全分离，分离效果较好。结果表明，在该色谱条件下进行乳蛋白单体的分离是可行的。

图2 牛乳乳清蛋白标准品的HPLC色谱图

图3 牛乳酪蛋白标准品的HPLC色谱图

2.2.2 不同牛乳中样品中酪蛋白的变化规律分析

（1）κ-CN的分析。目前发现κ-CN有11种类型[18]，从图4可以看出，3个胎次牛乳图谱中，κ-CN在第1胎牛乳和第2、3胎牛乳图谱中存在差异。图5可以看出，病牛乳和乳房炎乳的κ-CN与图4中存在明显的差异，显示其在不同种类牛乳中存在基因多态型。通过对其峰面积的计算比较其含量结果见表1，第1胎牛乳中κ-CN含量较高，达到12%，2和3胎牛乳中含量分别为11.6%和10%，呈现减少的趋势，病牛乳和乳房炎乳的含量分别为6.27%和10.6%，由于其基因类型和含量之间存在差异，因此可能是导致在酸乳和干酪加工中采用酸凝和酶凝时凝固时间和凝块硬度存在明显差异的主要原因。

图4 不同胎次牛乳蛋白质组成的HPLC色谱图

图5 不同病牛牛乳蛋白质组成的HPLC色谱图

（2）αs-CN的分析。从图4可以看出，3个胎次牛乳图谱中，αs-CN在各胎次中基因类型相同，但在图5中病牛乳与乳房炎乳与图4中存在明显差异，可见，当乳牛生病后乳中αs-CN基因出现明显变化。目前发现αs1-CN有9种多态性，αs2-CN有4种多态性，由于这次试验只有αs-CN混合标准品，无单独的αs1-CN和αs2-CN标准品，因此无法对其进行精准的计量，从表1可以看出，第1胎中αs-CN含量占28.5%,第2胎和第3胎中占到44.4%和54.6%，由此可出，随着产胎次数增加，酪蛋白中αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分别为30.24%和40.96%，处于中间状态。

（3）各样品中β-CN的分析。从图4可以看出，β-CN在各胎次中基因多态性较明显，图5显示两种病牛乳中β-CN基因类型相近，各种类牛乳蛋白中以单体和杂合体形式出现。从表1可以看出，随着产胎次数增加，所占百分数在逐渐减少，由41.6%降低到32.5%，未知病牛乳中β-CN含量较高，达到40%，而乳房炎乳较低，含量仅有32.2%。

2.2.3 不同牛乳样品中乳清蛋白的变化规律

乳清蛋白中，β-Lg的多态性是最早被发现的，目前已发现11种类型[19]，从图4可以看出，3个胎次牛乳中β-Lg呈现不同的基因形态，图5中两种病牛乳呈现的形态相同，但与正常牛乳形态不同。表1可以看出，β-Lg在第1胎次及两种病牛乳中含量较多，分别为14.7%、23.5%和12.9%。在第2和3胎次中含量较低，达到4.74%和1.6%。从实验结果看出，α-La只有1种，未见其多态性，目前发现α-La多态性最低，只有3种，且在病牛乳中未发现，与电泳结果有差异。并且α-La在乳蛋白中所占比例最小，最大只有3.28%左右。

3 结论

乳房炎乳与末知病牛乳与不同胎次牛乳电泳图谱在乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)这一区域条带较多，且条带明显下移；中间的中分子量组为三种酪蛋白(αs-CN、β-CN和K-CN)，其含量较高，分子量在20～40 ku之间，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差别不大；α-La和β-Lg仅从分子量看，各胎次牛乳在此区间差别不大，其中α-La分子量大约为14 ku，β-Lg分子量大约为18 ku。乳房炎乳条带较多，与其它牛乳相比差别较明显。

通过对不同种类牛乳蛋白色谱分析可知，κ-CN在不同牛乳中存在明显的差异，随着胎次增加含量减少，病牛乳和乳房炎乳的含量较低；αs-CN在各胎次中乳蛋白多态性类型相同，但在病牛乳与乳房炎乳差异明显，随着产胎次数增加，αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分别为30.24%和40.96%，处于中间状态；β-CN在各胎次中乳蛋白多态性较明显，随着产胎次数增加，所占百分数在逐渐减少，两种病牛乳中β-CN基因类型相近，含量居中；α-La未见其多态性，且在乳蛋白中所占比例最小，并且在未知病牛中未检测到；3个胎次牛乳中β-Lg呈现不同的基因形态，两种病牛乳呈现的形态相同，但与正常牛乳形态不同。在第1胎次及两种不同病牛乳中含量较多，在第2和3胎次中含量较低。