马肖 金永新 陈煜娟

摘要：目的 优化复方当归补血汤的提取工艺。方法 在单因素试验、析因设计、最速上升试验的基础上，以浸膏得率及阿魏酸、芍药苷、藁本内酯提取率的权重和为响应值，采用中心组合设计-响应面法优化复方当归补血汤的提取工艺。结果 最佳条件为超声提取60 min，提取溶剂为36%乙醇，料液比为1∶94。结论 该方法提取效率较高，操作简便，预测性良好。

关键词：复方当归补血汤；析因设计；中心复合设计-响应面法；提取工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.016

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0066-05

Abstract： Objective To optimize extraction technology of Compound Danggui Buxue Decoction. Methods On the basis of single factor test， factorial design， and fastest rise test， yield and weight sum of extraction efficiency of ferulic acid， paeoniflorin and ligustilide were set as response， and central composite design-response surface method was used to optimize the extraction technology of Danggui Buxue Decoction. Results The optimum conditions consisted of ultrasonic-wave extraction for 60 min， ethyl alcohol concentration 36% and the ratio of material to solvent = 1：94. Conclusion This method has high extraction efficiency， easy operation and good predictability.

Keywords： Compound Danggui Buxue Decoction； factorial design； central composite design-response surface method； extraction technology

当归补血汤出自李东垣《内外伤辨惑论》，由黄芪、当归按5∶1比例组成，具有补气生血功效。方中黄芪为君药，大补脾肺之气，以资生血之源，配以当归益血和营，两药相伍，阳生阴长，气旺血生，主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越，妇人经行、产后血虚发热头痛，以及疮痍溃后久不愈合等。在临床中，将中药复方随症加减，可加强、削弱或改变原方的作用，以适应不同病情的需要[1-4]。甘肃省第二人民医院中医科吴华主任医师根据多年临床经验，将当归补血汤与桃红四物汤合方加减，组成复方当归补血汤，在益气生血基础上兼能行血通瘀，因其良好的效果而在临床得到广泛使用。现拟将复方当归补血汤开发成为院内制剂，优化提取方法对该方的开发利用具有重要意义。当归、桃仁及川芎在复方当归补血汤中剂量较大，且对全方功效起主导作用。因此，本试验选择当归、川芎共有的有效成分阿魏酸、藁本内酯[5]，以及白芍的质量控制指标芍药苷，作为优化考察指标[6]，以其提取率与全方药物浸膏得率的权重和为评价指标，采用基于单因素试验、析因设计试验及最速上升试验的中心组合设计-响应面法，对复方当归补血汤的提取工艺进行优化，为该方的深度开发及综合利用奠定基础。

1 仪器与试药

美国Agilent 1100 LC/DAD系统，Thermo ODS HYPERSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），KH-500DE数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），BT125D电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），HH-S28s数显恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

阿魏酸对照品（批号0829-9702）、芍药苷对照品（批号0829-9702），中国食品药品检定研究院；藁本内酯对照品（批号CHB160428，纯度95%），成都曼思特股份有限公司。黄芪（批号20170210）、白芍（批号20170510）、熟地黄（批号20170703），甘肃·陇西百宝药业有限责任公司；当归（批号20171201）、桃仁（批号20160901），河北祁新中药颗粒饮片有限公司；红花（批号17103004），甘肃省国草药业有限公司；川芎（批号170801），成都济宏药业有限公司。水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取复方药物，精密加入一定体积分数的乙醇溶液，超声提取（频率40 kHz，功率80%）60 min，放至室温，补足质量，抽滤，取续滤液，即得。

2.2 浸膏得率的测定

按“2.1”项下方法，精密量取续滤液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中放置1 h冷却至室温，精密称定质量，计算浸膏得率。

2.3 阿魏酸、藁本内酯和芍药苷含量测定

采用内标校正法同步测定阿魏酸和藁本内酯的含量，以阿魏酸为内标物，通过相对校正因子（f=0.223 1）計算藁本内酯的含量，此方法准确、有效，并且能降低检测成本和时间[7]。采用外标法测定芍药苷的含量。

2.3.1 色谱条件

Thermo ODS HYPERSIL C18色谱柱（250 mm×4. 6 mm，5 ?m）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～10%B；5～15 min，10%～15%B；15～20 min，15%B；20～30 min，15%～25%B；30～50 min，25%～60%B）；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；阿魏酸检测波长为323 nm，芍药苷检测波长为230 nm，进样量10 ?L。在上述色谱条件下，供试品溶液中各组分分离度良好，色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品阿魏酸、芍药苷及藁本内酯0.596、2.276、3.24 mg，分别置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到浓度分别为0.059 6、0.227 6、0.324 mg/mL的阿魏酸、芍药苷及藁本内酯对照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。分别精密吸取上述对照品溶液2 mL定容于同一5 mL容量瓶中，得混合对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件进行分析，混合对照品溶液色谱图见图2。

2.3.3 线性关系考察

精密吸取上述阿魏酸对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别定容至5 mL容量瓶，精密吸取上述芍药苷对照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL分别定容至5 mL容量瓶，进样10 ?L，每个浓度平行进样3次，取峰面积平均值，以浓度（mg/mL）为横坐标，平均峰面积积分值为纵坐标，进行回归处理，回归方程及线性范围见表1。

2.3.4 精密度试验

取“2.3.3”项下高、中、低3个浓度的对照品溶液，每个浓度连续进样3针，计算峰面积的RSD，结果阿魏酸峰面积RSD=2.23%，芍药苷峰面积RSD=1.56%，表明仪器的精密度良好。

2.3.5 重复性试验

精密称取复方药物6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，计算浸膏得率，阿魏酸、芍药苷提取率及其权重和。权重和=阿魏酸提取率×25%+芍药苷提取率×25%+藁本内酯提取率×25%+浸膏得率×25%。结果RSD=1.83%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别放置0、3、6、12、24 h后进样分析，每次进样10 ?L，记录峰面积，结果阿魏酸、芍药苷峰面积的RSD分别为0.538%、1.428%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 加样回收率试验

精密称取复方药物9份，随机分为3组，每组分别精密加入低、中、高浓度的对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定阿魏酸、芍药苷及藁本内酯的含量，计算加样回收率。结果阿魏酸平均回收率为100.06%，RSD=1.986 7%；芍药苷平均回收率为99.75%，RSD=1.586 7%。

2.4 提取工艺优化

2.4.1 单因素试验

固定料液比、提取时间及提取溶剂，对比超声波提取法及回流提取法对复方当归补血汤的提取效率。结果发现回流提取法的提取效率略高于超声提取法，但超声提取法操作简便，效率较高，因此选择超声提取法。在此基础上，对提取溶剂、料液比及提取时间进行考察。结果见图3。

根据单因素试验结果，选择乙醇浓度30%～70%、料液比1∶50～1∶100、提取时间30～60 min为考察区间，进一步采用析因设计对上述因素进行分析。

2.4.2 二级全析因设计

析因设计可以有效控制或消除其他混杂因素对反应变量的干扰，分析更准确，能同时研究几个因素之间的交互作用，使分析结果更可靠和稳定，为选择最优处理组合提供依据[8]。因此，本试验以权重和为考察指标，筛选对复方药物提取率有显著影响的因素，试验安排及结果见表2、表3。

由表3可知，乙醇浓度与料液比对浸膏得率有显著影响（P<0.05），而提取时间为非显著性影响因素（P>0.05），故将提取时间确定为提取率最高的60 min，进一步采用最速上升试验对乙醇浓度和料液比进行优化。

2.4.3 最速上升试验

最速上升试验是沿着最速上升路径及响应有最大增量的方向逐步移动的方法。根据二级全析因设计结果，选择乙醇浓度（A）与料液比（B）为考察因素，以权重和为评价指标，确定两者的基本步长分别为10%与1∶10，试验设计见表4，试验结果见图4。可以看出，权重和的最高值在第3组，即乙醇浓度为50%、料液比为1∶80，故将其作为响应面试验的中心试验点。

2.4.4 中心组合设计-响应面法设计及结果

根据最速上升试验确定的响应面试验中心点，以权重和为评价指标进行设计，采用Design Expert8.0软件对结果进行分析处理，因素和水平见表5，试验设计和结果见表6。

对表6试验结果数据进行多元二次回归拟合，得回归方程Y=0.17-7.466×10-3A+0.029B-0.033AB（r=0.914 9，P<0.000 1）。根据确立的多项式模型，绘制乙醇浓度和料液比对权重和的二维等高线图和三维效应曲面图，并优选2个因素的最佳取值范围，结果见图5。

由图5可以看出，最佳提取条件为：超声提取60 min，提取溶剂为36%乙醇，料液比为1∶94。对优选的提取条件进行3次平行验证，结果权重和为0.23，预测值为0.239 2，RSD=2.77%，表明该模型预测性良好，提取条件重复性理想。

3 讨论

复方当归补血汤以黄芪、当归为君药，黄芪补益元气，当归补血活血；桃仁、红花为臣药，增强活血祛瘀功效；川芎理血中之气，行血活血，为血中之气药；白芍养血柔肝、缓急止痛；熟地黄补血滋阴。全方在益气生血的基础上兼能行血通瘀，在临床应用过程中收到良好的效果，具有开发成为医院院内制剂的良好潜力，故对其提取工艺进行优化尤为必要。

中药复方由若干药味组成，对其提取工艺优化时仅针对某一药味的单一成分进行考察，会导致有效成分的损失和提取工艺的片面性。因此，本试验选择方中主要药味的主要成分阿魏酸、芍药苷、藁本内酯及浸出物得率为考察指标，这些成分的药理活性基本代表了复方的功效，计算时取其权重和，能够较为综合反映提取工艺的优劣；本试验采用单因素试验选取各因素的水平范围，采用析因设计筛选出乙醇浓度与料液比对试验结果具有显著影响，进而采用最速上升试验找到各因素的合适取值，以此为中心组合设计-响应面法的中心试验点对乙醇浓度与料液比进行優化，得到最佳提取条件。中心组合设计-响应面法能通过非线性模型拟合来预测最佳试验条件，克服了正交设计、均匀设计等预测性较差、精确度不高的不足之处。同时，与析因设计、最速上升试验结合使用，能使工艺条件得到最大程度的优化。以此模式对中药及其复方的提取工艺进行优化，能够较为全面地筛选出最优提取工艺，提高其利用效率，为其进一步开发利用和产品研发奠定基础。

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（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-10-23；编辑：陈静）