韩瑞玲，万自成，孙思，毛晓露，汪明，李艳

缺血性脑卒中占所有脑卒中的65%～80%[1]，其发生与机体血脂代谢异常密切相关，脂质代谢通路相关调控基因多态性是脑卒中的遗传学研究热点[2]。载脂蛋白E（apolipoprotein E，Apo E）与血脂水平密切相关，在机体内参与胆固醇和其他血脂运输。ApoE基因多态性导致其编码蛋白的结构与功能异常，与高脂血症、动脉粥样硬化形成及其严重程度密切相关；而动脉粥样硬化是大动脉粥样硬化型（large artery atherosclero-sis，LAA）缺血性脑卒中的发病基础[3,4]。本研究应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-荧光探针技术检测本地区LAA型缺血性脑卒中患者ApoE基因多态性，研究其与脑卒中的关系，为此类疾病的早期预防和治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2017年12月在武汉大学人民医院神经内科住院的急性缺血性脑卒中患者179例为卒中组，男85例，女94例，年龄40～83岁，中位年龄为62岁；均经颅脑CT或（和）MRI确诊，均符合急性卒中治疗低分子肝素试验（trial of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST）分型[5,6]标准的LAA型。选择健康体检者104例为对照组，男51例，女53例，年龄37～81岁，中位年龄为60岁。2组所有成员者均为湖北籍汉族人，无血缘关系和异族通婚史，排除其他亚型的缺血性脑卒中（心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他明确病因型和不明原因型）、糖尿病、癌症、冠心病、肝肾及内分泌系统等疾病，排除正在服用降脂药物者。

1.2 主要仪器和试剂

7500实时荧光定量PCR仪购自美国AB公司，台式高速离心机、Naodrop 2000超微量紫外/可见分光光度计购自美国Thermo公司、涡旋振荡器购自江苏海门其林贝尔仪器厂，ADVIA 2400全自动生化分析仪购自德国西门子医疗系统有限公司。血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司、人类ApoE基因检测试剂盒购自武汉友芝友医疗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血液基因组DNA提取 受试者静脉采集外周血1～2 mL（EDTA抗凝管抽取，4℃保存），按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取和纯化DNA。纯化后血液基因组DNA浓度为5～15 ng/μL，－20℃保存。

1.3.2 PCR反应体系和扩增条件 反应体系：含特异性引物和探针的2种反应液（ApoE 526C＞T和ApoE 388T＞C）分别23 μL，基因组DNA 2 μL，总体积25 μL。扩增条件：UNG处理37℃10 min；预变性95℃5 min；变性95℃15 s，60℃60 s，40个循环。荧光信号的采集：FAM（Apo ε2 526C、Apo ε4 388T）、VIC（Apo ε2 526T、Apo ε4 388C）、ROC（内标）。所有样本检测中ROX通道Ct＜38，且扩增曲线有明显指数增长期则认为样本有效。

1.3.3 血脂测定 受试者清晨空腹采集肘静脉血2～3 mL于促凝管，3500 r/min离心5 min，于ADVIA 2400全自动生化分析仪检测样本血清中甘油三酯（triglyceride，TG），总胆固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平。按照ApoE基因的不同功能，将2组各分为3种基因表型[7]：ε2型，包括ε2/ε2、ε2/ε3；ε3型，包括ε2/ε4、ε3/ε3；ε4型，包括ε3/ε4、ε4/ε4。分别比较2组不同基因表型间的血脂水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件处理数据。计算各组基因型频率及等位基因频率，经计算确认符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=3.009，P=0.413），说明各等位基因频率分布数据可靠。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ApoE基因多态性分布结果

2组中ε3/ε3均为常见基因型，对照组ε3/ε3基因频率高于卒中组（P＜0.05），卒中组ε3/ε4和ε4/ε4分布高于对照组（P＜0.05）；卒中组ε4等位基因频率高于对照组（P＜0.05），ε3等位基因频率低于对照组（P＜0.05），见表1。性别对于ApoE基因型的分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 2组不同基因表型患者血脂水平比较

对照组ε4型TC、TG、LDL水平均高于ε2型和ε3型（P＜0.05或P＜0.01），见表3。卒中组ε4型TC水平显著高于ε2型和ε3型，LDL水平显著高于ε2型（均P＜0.01），见表4。

3 讨论

ApoE基因位于第19号染色体长臂3区，有4个外显子和3个内含子，目前研究认为其基因多态性与血脂异常的发生存在有一定的关联，是高脂血症及动脉粥样硬化性血管病的易感基因之一[8]。ApoE基因多态性主要涉及2个突变位点（526C＞T和388T＞C），可形成 3 种单倍型基因，即 Apo ε2（388T-526T）、Apo ε3（388T-526C）、Apo ε4（388C-526C），这3种单倍型基因可组成3种纯合子基因型（ε2/ε2、ε3/ε3和ε4/ε4）和3种杂合子基因型（ε2/ε3、ε3/ε4和ε2/ε4）。ApoE基因多态性可编码形成含不同氨基酸成分的ApoE异构体，主要区别在第112位和第158位氨基酸：Apo ε3编码产物为半胱氨酸和精氨酸，Apo ε4编码产物均为精氨酸，而Apo ε2编码产物均为半胱氨酸。这些异构体激活ApoE受体的能力不同，导致血脂代谢速度不同，因而多态性携带者动脉硬化程度及缺血性脑卒中的风险不同。ε4等位基因编码的异构体分解代谢速率较快且更易于与受体结合，使肝内ApoE受体摄取更多的Apo ε4脂蛋白，增加TC含量，同时反馈性地减少肝细胞表面的LDL受体，减慢LDL分解代谢，升高LDL水平，增加动脉粥样硬化斑块形成[9]，因此ε4成为缺血性脑卒中的危险因素。而ε3等位基因对缺血性脑卒中起保护性作用可能与降低TC和LDL水平、增高HDL有关[10,11]。

表1 各组ApoE基因型及等位基因频率分布[例(%)]

表2 ApoE基因型在不同性别LAA型脑卒中患者中的分布[例(%)]

表3 对照组中不同基因表型患者血脂水平比较（mmol/L,±s）

表3 对照组中不同基因表型患者血脂水平比较（mmol/L,±s）

注：与ε4型比较，①P＜0.05，②P＜0.01

基因表型ε2型ε3型ε4型例数20 81 3 TC 4.59±1.15 4.49±0.85 5.69±1.32 TG 1.73±0.46 1.39±0.58 2.27±0.42②②②HDL 1.47±0.43 1.40±0.54 1.34±0.37 LDL 2.07±0.66 2.34±0.79 3.05±0.87② ①①

表4 卒中组中不同基因表型组血脂水平比较(mmol/L,±s)

表4 卒中组中不同基因表型组血脂水平比较(mmol/L,±s)

注：与ε4型比较，①P＜0.01

基因表型ε2型ε3型ε4型例数23 126 30 TC 4.37±0.82 5.00±0.69 6.21±0.78① ①TG 1.76±0.77 1.79±0.75 2.28±1.05 HDL 1.21±0.31 1.17±0.42 1.17±0.31 LDL 2.09±0.66 2.81±0.53 3.18±0.80①

本研究结果显示，ε3/ε3基因型在卒中组和对照组均较多，卒中组ε3/ε4、ε4/ε4等位基因频率高于对照组，提示武汉地区汉族LAA型脑卒中患者中ε4为遗传易感因子，这与海南[12]、郑州[13]、沈阳[14]等地区的报道相似，而桂西壮族人群的研究表明ε4等位基因与缺血性脑卒中无明显关系[15]。本研究中卒中组ε3等位基因频率低于对照组，说明本地区LAA型脑卒中患者中ε3可能具有保护性作用，这与海南黎族及郑州汉族人群研究中报道的ε2具有保护作用的结论不一致[12,13]。这些不一致的原因与研究对象的遗传背景及选择标准不同、研究例数不同等有关，尚需要进行更大样本的深入调查分析。此外，由于脑卒中的病因和发病机制十分复杂，有研究报道RYR-3基因[16]，C5基因[17]，PPARG基因[18]等基因多态性与LAA型脑卒中亦具有一定相关性，这提示下一步应利用多基因多位点的高通量测序技术对脂质代谢途径中多靶点基因进行更全面的分析和研究。

综上所述，ApoE基因多态性在武汉地区LAA型脑卒中患者中分布比较普遍，ε4可能为本地区LAA型脑卒中人群的遗传易感因子之一且与血脂水平相关，这对于临床实践具有重要的指导意义，根据ApoE基因型的检测结果可提示受试者血脂水平，对防治动脉粥样硬化等心脑血管疾病、预防LAA型脑卒中有一定价值。本研究为单中心小样本研究，要得到确切结论，尚需进一步研究。