吴凯，魏赵延，李思慧，林伟强

（江苏正大天创生物工程有限公司，江苏泰州 225300）

叶酸是一种水溶性的B族维生素（维生素B9），为具有生物活性的叶酸盐（folate）的前体，其在体内的活性形式是5-甲基四氢叶酸，能传递一碳基团（甲基或甲酰）给脱氧尿苷酸，使之变为脱氧胸苷酸，进而合成DNA，是合成核酸、细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素，有助于预防神经管缺陷，包括脊柱裂和无脑儿等非常严重的出生缺陷的发生。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低体重、唇腭裂、心脏缺陷等发病率。

亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylene Tetrahydrofolate Reductase，MTHFR）是细胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与DNA的合成与甲基化作用。MTHFR基因常见的突变有两种[1]：677位点C/T多态性与1 298位点A/C多态性。其中，C677T位点是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点，在中国的发生率为45.2%。研究表明[2-4]，677位点由C突变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低，进而会使同型半胱氨酸（Hcy）代谢受阻，在体内积聚引起高同型半管氨酸血症。高同型半管氨酸血症与多发性流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎有关，且与早产密切相关。另外，1 298位点A变为C后，谷氨酸被丙氨酸取代，同样使MTHFR的酶活性下降，引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低，该位点在中国突变的频率高达18.6%。

本研究通过建立一种简单、准确的快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，为临床指导孕妇服用叶酸提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集来自泰州妇幼保健院的孕妇随机静脉血标本100例，孕周2～36周。用真空采血管空腹采集各研究对象肘静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝，样本置4 ℃保存。

1.2 仪器与试剂

7500实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔公司）；ST16R台式高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔公司）；NanoDrop微量分光光度计(美国赛默飞世尔公司）；血液DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；GoldStarTaqMan Mixture（康为世纪生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物、探针设计

通 过 NCBI数 据 库（www.ncbi.nlm.nih.gov） 获得MTHFR基因的全长编码序列（GenBank：NM_005957.4），并进一步找到对应的基因组序列，用primerexpress 3.0软件设计ARMS引物和探针，并根据人类基因组中相对保守的基因GAPDH基因的保守区域设计引物及荧光探针作为内标，引物及荧光探针由上海生工公司合成。检测引物以及测序的引物序列见表1。

1.3.2 样本扩增及测序

构建MTHFR-677和1298位点的PCR扩增总体系为 50μL，包括 GoldStar TaqMan Mixture 25μL，上、下游引物各1μL，基因组DNA 2μL，ddH2O补足至 50μL；PCR 循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 个循环。取 10μL PCR 扩增产物送上海生工公司进行序列测定。根据测序结果，挑选出MTHFR基因677和1 298位点野生型和突变型样本进行荧光定量PCR扩增。

表1 MTHFR多态性位点及参考品品构建所用引物探针

1.3.3 阳性参考品的构建

实验中的阳性参考品质粒由上海捷瑞生物科技有限公司合成。将含有5 μg质粒MTHFR-677-C、质粒MTHFR-677-T、质粒GAPDH、质粒MTHFR-1298-A、质粒MTHFR-1298-C、质粒HBV溶于200 μL纯化水中，并进行梯度稀释至10-5。将100μL 10-5质粒MTHFR-677-C、100 μL纯化水、100 μL 10-5质粒GAPDH进行混合成为MTHFR-677-CC型阳性参考品。将100 μL 10-5质粒MTHFR-677-T、100 μL纯化水、100 μL 10-5质粒GAPDH进行混合成为MTHFR-677-TT型阳性参考品。100 μL 10-5质粒MTHFR-677-C、100 μL 10-5质 粒 MTHFR-677-T、100 μL 10-5质 粒GAPDH进行混合成为MTHFR-677-CT型阳性参考品。 将 100 μL 10-5质 粒 MTHFR-1298-A、100 μL纯化水、100 μL 10-5质粒GAPDH进行混合成为MTHFR-1298-AA型阳性参考品。将100 μL 10-5质粒 MTHFR-1298-C、100 μL纯化水、100 μL 10-5质粒GAPDH进行混合成为MTHFR-1298-CC型阳性参考品。将100 μL 10-5质粒MTHFR-1298-A、100 μL 10-5质粒 MTHFR-1298-C、100 μL 10-5质粒GAPDH进行混合成为MTHFR-1298-AC型阳性参考品，阳性参考品的浓度为83 ng/μL。

1.3.4 荧光定量PCR扩增和结果判读

PCR反应总体积为25 μL，包括2×TaqMan Mixture 12.5 μL，上、下游引物（ARMS引物、下游引物、内标正向引物、内标反向引物）各1 μ L，10 μmol/L检测探针各0.5 μL，内标探针0.5 μL，基因组DNA 2 μL，并用 ddH2O 补足体积至 25 μL。检测MTHFR-677位点和MTHFR-1298位点分别在2个PCR管中进行。PCR循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃115 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。用7500 实时荧光定量PCR仪在60℃时收集荧光信号,荧光检测通道设置时，2管均选择FAM、VIC和ROX通道，淬灭基团选择“NFQ-MGB”。结果判读：记录每个检测通道的Ct值，当反应的内参通道（ROX）有扩增曲线，且Ct＜30，但2管的FAM通道或者VIC通道均没有扩增曲线，可能为样本DNA存在PCR抑制剂，应重新取样提取基因组DNA。样品管进行分析，按表2对MTHFR基因多态性进行判定。

表2 结果判定表

2 实验与结果

2.1 重复性实验

分 别 取 MTHFR-677-CC、MTHFR-677-TT、MTHFR-677-CT、MTHFR-1298-AA、MTHFR-1298-AC、MTHFR-1298-CC按照最佳反应体系，分别进行批内重复性实验，在同1天，同1批次每种型、每个浓度样本各做10次检测，批次1、批次2和批次3各重复检测1次，计算Ct值的变异系数。

重复性检测结果见表3，4。结果表明，MTHFR-677位点和1298位点重复性检测的CV值均处于较低水平。

表3 MTHFR-677位点重复性检测结果

表4 MTHFR-1298位点重复性检测结果

2.2 最低检出限检测及结果

以质粒阳性参考品为模板，进行10倍连续稀释，分别取2 μL作为模板，用实时荧光定量PCR仪按照1.4.3的方法进行检测，确定该方法的最低检出限。结果显示，采用本方法测得的DNA浓度最低检出限8.3×10-3ng/μL。详见图 1。

图1 最低检出限检测结果

2.3 特异性检测结果

利用NCBI数据库的对实验设计的引物探针进行系列比对表明，实验设计的引物探针特异性良好。677位点引物与1298位点质粒标准品交叉检测无荧光信号产生，同样1298位点引物检测677位点质粒标准品无荧光信号产生。阴性对照（ddH2O）无荧光信号产生，整体特异良好。

2.4 临床样本检测

按照血液DNA提取试剂盒说明书操作提取各研究对象的基因组DNA，取1 μL样本用NanoDrop微量分光光度计检测浓度及纯度，浓度低于10 ng／mL或吸光度（A260/280）＜1.7的样本需重新提取至合格为止。从合格的样本中随机选取50例样本，并用本公司构建标准品的引物进行核酸扩增，PCR产物送上海生工公司用对MTHFR的677和1298位点进行多态性分析，其中MTHFR的677位点测序检测为C表明样本为野生型，为T则为突变型，同时存在C/T的双峰则为杂合型；MTHFR的1298位点测序检测为A表明样本为野生型，为C则为突变型，同时存在C/A的双峰则为杂合型。以评价本实验建立的方法与测序法结果的一致性。荧光PCR检测结果示：MTHFR-677-CC 16例，MTHFR-677-CT 30例，MTHFR-677-TT 4例，MTHFR-1298-AA 33 例，MTHFR-1298-AC 15例，MTHFR-1298-CC 2例。

3 讨论

本研究建立人MTHFR基因多态性的检测方法结合了ARMS引物和TaqMan探针各自的优点，可以实现对突变样本在的快速检测和结果判断。提供2管反应同时检测人类 MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单、检测通量大、检测成本低的优点。试剂盒验证了最低检出限，特异性和重复性等性能指标，结果表明建立的方法能检测8.3×10-3ng/μL浓度的质粒标准品。特异性实验表明MTHFR-677和1298位点各自的PCR 扩增体系检测对方的质粒标准品无交叉反应,整个实验体系不存在非特异性扩增的问题。精密度试验结果表明其Ct的CV＜5%，表明重复性良好。

王苏梅等[5]报道应用TaqMan探针实时PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法，其方法是将MTHFR基因多态性位点设计在MGB探针的正中间，利用探针的特异性实现MTHFR基因多态性的识别；然而本实验结果表明，两者存在交叉检测，极易导致试验结果的不准确，另外一次只能检测一个位点。

王佳等[6]使用扩增阻滞突变系统快速检测MTHFR基因多态性，但其采用的方法仍然需要通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR结果，该方法的明显缺点是存在电泳导致的PCR扩增产物污染。测序法是检测MTHFR基因多态性的金标准，但是操作耗时长且灵敏度低，难以实现大规模推广，与测序法相比本实验建立的方法优势明显，探针灵敏度高、准确性强，2～3个小时内即可得出结果，因此可以大规模运用和推广。当然，本实验尚存在不足之处，虽然本实验过程不存在PCR开盖污染的可能，但是更安全的做法是在PCR扩增体系中添加UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）和dUDP，以完全消除PCR扩增产物对后续PCR扩增产生污染的可能。