林文铭

0 引言

盐酸卡替洛尔滴眼液在临床上主要用于治疗青光眼、高压眼症。该滴眼液处方中的抑菌剂苯扎氯铵，可以提高该制剂的稳定性，防止因开启使用过程中被微生物污染变质而产生用药安全隐患。虽然苯扎氯铵是有药用标准的常用防腐剂，常用于眼用制剂[1](滴眼液中苯扎氯铵常用限量为0.003%～0.020%)，但其具有一定的毒性。有报道，即使在1/1 000的浓度下，经常或长时间使用会引起角膜功能障碍，破坏角膜屏障功能，引起变态反应性结膜炎、视力减退等不良反应。所以必须严格控制眼用制剂中防腐剂苯扎氯铵的含量。我国2015年版药典中，盐酸卡替洛尔滴眼液的质量标准中尚无防腐剂含量的测定方法[2]，因此，有必要建立该制剂中防腐剂含量的测定方法，以评价其在保障一定的抑菌效力的情况下，用量采用最小有效浓度。这样既能产生药理作用，又不会对眼睛产生较大的刺激和损害。苯扎氯铵为氯化二甲基苄基烃铵的同系物组成的混合物(结构式如图1所示，R为烃基=C8H17～C18H37)，也称为二甲基苄基烷基氯化铵，主要由十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵和十六烷基二甲基苄基氯化铵3种同系物组成。根据苯扎氯铵对照品(1.11%，w/v)的标签说明可以知道其主要同系物组分为苯扎氯铵C12同系物和苯扎氯铵C14同系物，比例依次为66.27%、33.33%。本研究对盐酸卡替洛尔滴眼液中的苯扎氯铵进行检测，发现其同系物组分为C12(R为烃基=C12H25)，因此，测定的苯扎氯铵含量以苯扎氯铵C12同系物(C21H38ClN) 为指标表示。

图1 苯扎氯铵分子结构(R为烃基=C8H17～C18H37)

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司) ；AB265-S型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；UV-1601紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂 盐酸卡替洛尔滴眼液(5 ml∶

100 mg)：中国大冢制药有限公司(批号：1701012、1701022、1701032)；苯扎氯铵对照品(1.11%，w/v)：中国食品药品检定研究院(批号：100680-201607，规格：每1 ml 中含苯扎氯铵11.10 mg，其中含n-C12H25取代同系物为66.27%，n-C14H29取代同系物为33.33%)；盐酸卡替洛尔原料药：上海升德医药有限公司(批号：1609011)；醋酸铵、三乙胺、冰醋酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯(德国Merck 公司)，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：YMC Triart C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：3 mmol/L醋酸铵水溶液(加1.5%三乙胺，用冰醋酸调pH至6.0±0.5)-乙腈=30∶70；流速：1.0 ml/min；检测波长：262 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液 直接取用盐酸卡替洛尔滴眼液制剂成品作为供试品溶液(含苯扎氯铵约为80 μg/ml)。

2.2.2 对照品溶液 精密量取苯扎氯铵对照品0.4 ml，置50 ml量瓶中，加蒸馏水稀释定容，制得浓度为88.8 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 系统适用性溶液 取苯扎氯铵对照品溶液与供试品溶液1∶1混匀，作为系统适用性溶液。

2.3 专属性试验 分别精密量取“2.2”项中配制的对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液各20 μl，在“2.1”项色谱条件下，注入高效液相色谱仪检测，记录色谱图，如图2所示。结果显示，对照品溶液中苯扎氯铵的保留时间分别为7.630 min(nC12H25)和13.690 min(nC14H29)；对比确定供试品溶液使用的为苯扎氯铵C12同系物；苯扎氯铵与主药盐酸卡替洛尔峰的分离度为19.3，苯扎氯铵(nC14H29)拖尾因子为1.317。结果表明，主药及其他辅料和溶剂水均不干扰苯扎氯铵的检测，各峰分离度符合要求，苯扎氯铵拖尾因子符合要求。专属性、系统适用性良好。

图2 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 精密量取苯扎氯铵对照品0.8 ml，置50 ml容量瓶中，加水稀释至刻度,定容摇匀作为储备液。再分别精密量取该溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5 ml，分置于10 ml容量瓶中，加水稀释定容至刻度,分别制得相当于“2.2.2”项下对照品溶液(以n-C12H25取代同系物计)含量的20%、40%、60%、80%、100%、120%、140%、150%的8组溶液。

分别精密量取该8组溶液各20 μl进样测定，记录其峰面积值，如表1所示。以苯扎氯铵相对百分含量(C)为横坐标、相应峰面积值(A)为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线方程为A=65.54 C-0.916 7(r=0.999 9)。结果表明，当检测浓度在对照品溶液标示量的20%～150%的范围内，苯扎氯铵的含量和相应峰面积值呈良好的线性关系。

表1 线性关系考察试验结果

2.5 精密度试验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液20 μl，在给定的色谱条件下，重复进样测定6次，记录其峰面积值(以n-C12H25取代同系物计)，如表2所示。结果显示，苯扎氯铵色谱峰面积值的RSD为0.18%(n=6)，符合要求，表明实验重复性和仪器精密度良好。

取“2.2.2”项下对照品溶液适量，进行逐级定量稀释，信噪比为3∶1时作为最低检测限(以n-C12H25取代同系物计)，此时苯扎氯铵的检测限浓度为0.37 μg/ml；信噪比为10∶1时作为定量限，苯扎氯铵的定量限浓度为1.47 μg/ml。经计算得本品的检测限为7.4 ng，定量限为29.4 ng。由于供试品溶液中苯扎氯铵的浓度约为80 μg/ml，进样量约为1 600 ng，远高于检测限，所以，本法的检出限符合检测要求。

2.6 准确度试验 精密量取苯扎氯铵对照品0.2、0.4、0.6 ml，分别置于50 ml容量瓶中，加入含盐酸卡替洛尔原料药的空白溶液(不含苯扎氯铵)，稀释定容至刻度，摇匀，分别制得相当于对照品溶液含量的50%、100%、150%的3种不同浓度的样品溶液，分别进样测定并记录其峰面积，每种样品溶液平行测定3次。将所得色谱峰面积值代入标准曲线方程，计算其相对百分含量，结果见表3。苯扎氯铵在3种不同浓度溶液的平均回收率为99.9%，RSD为1.0%，均符合要求，方法准确度良好。

表3 准确度实验结果

2.7 稳定性试验 取“2.2.1”项下供试品溶液(批号：1701012)，放置0、2、4、6、8、10、12 h时依次进样测定，测得苯扎氯铵色谱峰面积值(以n-C12H25取代同系物计)，如表4所示。计算得峰面积值的RSD为0.05%(n=7)，结果表明，供试品溶液在12 h内含量无明显变化，稳定性良好。

表4 稳定性试验结果

2.8 耐用性试验 分别在“2.1”项色谱标准条件下，仅分别改变柱温为35 ℃、45 ℃(其他条件同“2.1”项下色谱条件)、仅分别改变流速为0.8、1.2 ml/min(其他条件同“2.1”项下色谱条件)的色谱条件下，分别进样测定苯扎氯铵对照品溶液(A)和供试品溶液(B)，并记录其峰面积，计算供试品溶液中苯扎氯铵的相对含量(以n-C12H25取代同系物计)，见表5。

表5 耐用性实验结果

结果显示，在上述色谱条件改变的情况下，苯扎氯铵峰与主药峰的分离度均>1.5，苯扎氯铵峰的拖尾因子均<1.5，供试品溶液中苯扎氯铵含量变化的RSD为0.067%(<2.0%)。所以，检测条件，包括柱温和流速等微小的变化均不影响苯扎氯铵的含量检测，苯扎氯铵峰与主药盐酸卡替洛尔峰的分离度和拖尾因子均符合要求，耐用性良好。

2.9 滴眼液中苯扎氯铵含量测定 精密量取3个批号(批号：1701012、1701022、1701032)的供试品溶液，进样测定，记录其峰面积值，每个批号的供试品溶液平行测定3份。将峰面积值代入标准曲线方程计算其相对含量，再计算含量平均值。结果见表6。结果表明，测定含量值均为对照品溶液标示量的80.0%～120.0%范围内[2]，符合要求。

表6 含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本研究中，选择检测波长时，在参考了文献[2-6]报道的有关苯扎氯铵检测波长的不同值后，再经紫外分光光度法在200～280 nm波长范围内进行扫描，确定苯扎氯铵在262 nm波长处有最大吸收峰，且有满意的吸收值。因此，选择262 nm为检测波长。

3.2 色谱柱、流动相和柱温的选择 苯扎氯铵作为季铵盐类化合物，色谱出峰易拖尾，峰形较差。参考文献[2-6]后，通过条件摸索，发现随着柱温的升高，峰形有所改善，但柱温过高，对色谱柱的使用寿命影响较大，故采用羟基封端较好的色谱柱。通过流动相的摸索，在柱温40 ℃条件下，可将苯扎氯铵拖尾因子控制在1.3左右，优于文献中的标准，故将柱温选为40 ℃。

3.3 方法优点 我国2015年版药典中盐酸卡替洛尔滴眼液的质量标准中尚无防腐剂含量的测定方法，有必要建立该制剂中防腐剂含量的测定方法。通过本文系统的方法学验证，本方法测定盐酸卡替洛尔滴眼液中的防腐剂苯扎氯铵的含量，操作简便快速，精密度高，专属性强，重现性好，测定结果准确可靠，适用于盐酸卡替洛尔滴眼液中苯扎氯铵的限量控制。