李玉明 王现轩 田蒙鸽 赵博厚 李永胜 刘建轲 苏衍萍

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

视网膜血管网的改变是视网膜病变的显著特点，所以视网膜消化铺片技术在视网膜病变研究中占有不可或缺的地位。但由于消化、展片等操作技术较为困难，消化铺片的成功率较低。目前常规采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化的方法对短期保存的视网膜组织进行消化铺片。但由于实验研究中的各种原因常导致标本固定时间过长，加大了制片难度。本研究中，我们将国内外各种经验进行总结，全程应用恒温摇床，采用酶联合消化技术，探索不同固定时间的大鼠视网膜最适的酶消化浓度和消化时间，为视网膜血管病变的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠(济南朋悦实验动物繁殖有限公司)；Proteinase K (中山金桥)；Trypsin 1∶ 250 (Blotopped);苏木素、伊红染色液、马来酸、Tris、盐酸及氢氧化钠均为国产分析纯(天津市凯通化学试剂有限公司)；LZY系列恒温摇床(常州诺基仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1取材及固定

正常SD大鼠12只，颈椎脱臼法处死后，摘取眼球，随机分3组于4%甲醛溶液中固定2天、3个月及7个月。

1.2.2消化液的配置

0.1%蛋白酶K消化液的配置：首先配置Tris-HCl缓冲液：取Tris 1.21 g、蒸馏水8 ml、盐酸0.6 ml，蒸馏水定容至10 ml，稀释100倍后，调节pH为7.4～8即可。用Tris-HCl缓冲液配置0.1%蛋白酶K消化液。胰蛋白酶消化液的配置：分别取1 mol/L马来酸溶液10 ml，1 mol/L Tris 溶液10 ml和0. 5 mol/L NaOH 溶液24 ml，加蒸馏水稀释至100 ml，调节pH 为7.8，配制成Tris-Maleic 缓冲液。用Tris-Maleic 缓冲液配制3%、6%、9%胰蛋白酶消化液[1-2]。配制好的蛋白酶K消化液及胰蛋白酶消化液均置于4℃保存。

1.2.3视网膜铺片的制备

将固定好的眼球取出，用眼科剪沿距齿缘剪开巩膜，置于PBS中小心去除眼前节和晶状体，以视神经乳头为中心将眼球壁均匀分成3份，轻轻分离视网膜，并将视网膜在PBS中浸洗12 h。12 h之后将视网膜置入蒸馏水中，37℃孵育1 h，蒸馏水漂洗。孵育后的视网膜每组再随机分为两份，分别进行常规胰蛋白酶消化和蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化。

胰蛋白酶消化法中，首先将孵育后的视网膜放入胰蛋白酶消化液中，浓度参考文献并加以调整[1]。固定2天的视网膜置于3%胰酶消化液中，固定3个月的视网膜置于6%胰酶消化液中，固定7个月的视网膜置于9%胰酶消化液中。并将视网膜在恒温摇床中37℃、70 r/min进行消化。

蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法中，先将漂洗后的视网膜放入0.1%的蛋白酶K中[2]，恒温摇床56℃、70 r/min消化13～20 min，消化后蒸馏水漂洗。因固定时间不同，消化时间需以感光层细胞脱落时为准。漂洗后，将视网膜置于胰蛋白酶消化液中，胰蛋白酶浓度与常规胰蛋白酶消化法相同，再将视网膜在恒温摇床中37℃、70 r/min进行第二次消化。

两种消化法均以视网膜神经组织消化完全为标准记录消化时间。消化结束后，在蒸馏水中轻轻吹打，去除粘附在视网膜血管网上的细胞。用吸管将消化后的视网膜血管网移至防脱片上，轻轻震荡，待其基本展开后，用吸管轻轻吸取防脱片上的蒸馏水，依靠蒸馏水的轻微流动将视网膜血管网完全展开,自然干燥。

1.2.4视网膜血管铺片HE染色

视网膜血管铺片HE染色方法参考文献[2]，中性树脂封片后镜下观察。

1.2.5统计学处理

2 结 果

2.1 不同固定时间的视网膜消化时间

不同固定时间的视网膜分别行常规胰蛋白酶消化和蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化。消化时间见表1。

表1 不同固定时间的视网膜消化时间一览表

2.2 消化后视网膜血管铺片染色结果

消化完成，经HE染色后的视网膜血管铺片(图1)可见，固定2天、3个月的视网膜在两种消化方法中，成片效果基本相同，血管网铺片完整，各级血管形态、走向清晰，无断裂，血管内皮细胞形态及细胞核均清晰显示，但联合消化法消化的更为彻底几乎无其他组织残留。固定7个月的视网膜，采用单纯胰蛋白酶消化的，存在血管断裂现象，而采用联合消化法的视网膜血管断裂现象优于前者。但可能因为胰酶浓度高、消化时间长的原因，导致组织细胞损伤，固定7个月的视网膜血管胞质染色不均匀，且血管较为曲折，成片效果略差于固定2天、3个月的视网膜。

3 讨 论

视网膜铺片技术是视网膜血管病变研究中必不可缺的重要技术。Kuwabara等人[3]首次于1960年创立了胰蛋白酶消化视网膜的方法，为视网膜血管铺片研究提供了新的技术手段。1963年Ashton[4]改进Kuwabara的方法，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法成功制备了猫视网膜血管铺片。此后通过各个学者的研究改进[5-7]，视网膜消化铺片技术才愈发完善。

但很多时候，因为实验设计或实验室条件等限制，实验动物取材后并不能及时进行下一步处理，因此导致视网膜在甲醛中保存时间过长，而致后期消化困难。为了解决这一难题，我们对联合消化法加以改进[1]，调整了胰蛋白酶的浓度及消化时间，并将消化场所由恒温箱改为恒温摇床。

由于长时间固定导致的视网膜消化困难主要表现在消化时间的把握，一方面，消化不完全，导致血管无法充分暴露，影响观察；另一方面，消化过度又会导致血管断裂，组织不清。所以消化时间的适当缩短有利于整个消化过程的掌控。在本实验中，我们通过蛋白酶K-胰蛋白酶联合的方法适当缩短了消化时间，进而做到对消化过程的合理控制。与此同时，联合消化法和恒温摇床技术也提高了消化成片率，这对实验效率以及成功率有着显著积极的意义。蛋白酶K能够快速有效的使组织细胞裂解，因此蛋白酶K可对视网膜感光层细胞进行初步消化。 因为蛋白酶K可透过细胞膜，破坏细胞核，所以视网膜层需漂洗后才可进行第二步消化[2]。

A：固定2天的视网膜；B：固定3月的视网膜；C：固定7月的视网膜；1：胰蛋白酶消化法；2：蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法

在消化过程中，我们还将恒温箱改为恒温摇床，不仅省去了人工摇动的步骤，也在一定程度上促进了消化过程的进行。在成片效果上，由于较长消化时间，难控制的消化过程，仍然无法避免组织细胞的损伤，所以在固定7月的视网膜血管中表现为不均匀的胞质染色，成片效果略差。通过对消化浓度的调整，在恒温摇床中采用联合酶消化的方法显著改善由于固定时间过长而导致的消化困难的问题，并且减少了消化时间，提高了消化成片率，但关于胰蛋白酶的最适消化浓度还需进一步研究。

在视网膜消化铺片制备中，消化完成的血管网易折叠，单纯用外力展开又容易造成血管的断裂，加大了铺片的难度。特别是在某些实验研究中，需要测量视网膜血管面积分析实验结果，所以在该类实验中，铺片技术在一定程度上决定了结果的准确性与完整性。对此，研究组成员进行讨论，现将心得陈述如下：首先在防脱片上滴加少量蒸馏水，并将消化完全的视网膜转移其中，轻微震荡后使用微量移液枪，沿蒸馏水边缘缓慢吸取，通过蒸馏水的流动，促使其完全展开，然后再次轻微震荡载玻片，使因外力过度展开的血管网稍加恢复，但不要将载玻片上的水吸干净。展片完成后将其自然干燥，即可进行下一步实验操作。值得注意的是，由于蛋白酶K能穿透细胞膜，破坏细胞核，所以在后期染色过程中应减少核染时间，防止染色过度而影响观察效果。

通过结合国内外多学者的研究结果并加以调整，应用蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法，并改进胰酶浓度、消化时间及消化场所，解决了长时间固定的视网膜消化问题，稳定性较好，得到了和短时间固定组织近乎相同的形态学结果。但其最适消化浓度和时间，以及该种消化方法是否影响视网膜组织超微结构等方面，还需进一步深入研究。