尼美舒利逆转Th1/Th2偏移调节胆管癌细胞增殖的机制研究

2018-11-06斌王道明朱家胜夏亚斌

山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2018年11期

孔琦黄强陈斌王道明朱家胜夏亚斌

(1.皖南医学院弋矶山医院胃肠一科，安徽芜湖 241000； 2.安徽省立医院普外科，安徽合肥 230032)

机体的免疫状态与肿瘤的发生、发展关系密切，正常机体的Th1/Th2型细胞因子处于动态平衡，对维持机体正常的免疫功能至关重要，当Th1/Th2平衡失调并向Th1或Th2转化时，称为Th1/Th2的偏移[1]。研究表明Th1/Th2偏移与肿瘤、自身免疫性疾病、微生物感染、移植排斥反应等多种疾病有关[2-4]，Th1/Th2偏移与恶性肿瘤的关系已成为当前人们研究的一个热点，我们以白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ代表Th1型细胞因子，以IL-4、IL-6代表Th2型细胞因子，观察选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞Th1/Th2偏移的逆转作用，探讨其抗肿瘤的免疫学机理。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝内胆管癌细胞系HCCC-9810购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，RPMI1640培养基购自Gibco公司(美国)，MTT为Sigma公司(美国)产品，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6 ELISA试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，FITC标记的抗IFN-γ和PE标记的抗IL-4单抗分别购自Biolegend公司。尼美舒利购自Sigma公司(美国)，相对分子量为308.3。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及药物准备人肝内胆管癌细胞系HCCC-9810接种于含10%小牛血清、1×10 U/L青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内常规传代培养，每2～3 d传代1次。取对数生长期细胞进行实验。取308.3 mg尼美舒利溶于1 ml的DMSO中，加入9 ml的培养液配成100 mmol/L的母液，实验当日用RPMI-1640培养液稀释，配成不同浓度的尼美舒利，使其终浓度分别为25、50、100、200 μmol/L。取对数生长期胆管癌细胞,用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml，接种于6孔培养板内，每孔2 ml，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h，设实验组和对照组进行实验，实验组加入不同浓度的尼美舒利，对照组不加药，检测相关指标。

1.2.2体外细胞增殖抑制实验(MTT比色法) 以每孔1×104个细胞将对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板中,分别加入不同浓度尼美舒利，每组4个复孔,设阴性对照组，于48 h、72 h、96 h后倾去培养液，用MTT法检测细胞吸光度，空白对照调零并计算抑制率。抑制率(IR)=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3尼美舒利作用后的透射电镜观察将尼美舒利作用后的细胞置于EP管中，2000 r/min离心5～10 min后弃上清，固定后梯度酒精脱水，用环氧树脂包埋，超薄切片机切片后染色，在透射电子显微镜上观察细胞形态变化，记录结果并照相。

1.2.4细胞因子测定取对数生长期胆管癌细胞接种于6孔培养板内，每孔2 ml，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h后设实验组和对照组进行实验，实验组加入不同浓度的尼美舒利，对照组不加药，每组设3个复孔，72 h后分别吸取上清液，用ELISA法分别检测IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ表达水平。

1.2.5Th1、Th2亚群流式细胞仪检测收集不同浓度尼美舒利处理48 h的HCCC-9810细胞，离心后弃上清；细胞用PBS缓冲液洗漂洗，加入固定液0.5 ml固定20 min，1500 r/min离心5 min，弃上清。加入2 ml穿透液，室温暗处10 min，1000 r/min离心5 min，加入FITC标记的抗IFN-γ和PE标记的抗IL-4单抗，避光孵育30 min，2 ml穿透液漂洗1次，0.5 ml多聚甲醛悬浮细胞后应用流式细胞仪检测IFN-γ和IL-4水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 尼美舒利对HCCC-9810细胞的抑制作用

MTT结果显示尼美舒利呈明显的浓度和时间依赖性抑制人胆管癌HCCC-9810细胞的生长，随药物浓度增加、作用时间延长，细胞生长抑制率逐步增加，见图1。

图1 尼美舒利对胆管癌细胞生长的抑制作用

2.2 尼美舒利作用后的透射电镜观察

正常生长的HCCC-9810细胞透射电镜下细胞器丰富，细胞表面覆有大量绒毛(图2A)，尼美舒利作用后的细胞形态发生改变，细胞表面微绒毛减少，切片中出现细胞核固缩，染色质边集，新月体形成等细胞凋亡的形态学改变(图2B)。

A：正常生长的HCCC-9810细胞；B：尼美舒利作用后的细胞

2.3 ELISA法检测尼美舒利对胆管癌细胞因子表达的影响

加入不同浓度的尼美舒利作用于胆管癌细胞后，实验组中IL-2、IFN-γ浓度呈现上升趋势，而IL-4、IL-6浓度下降，且随浓度上升作用明显，两组比较有统计学意义，见表1。

表1 ELISA法检测尼美舒利对胆管癌细胞因子表达的影响

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.4 尼美舒利对HCCC-9810细胞Th1/Th2的影响

流式细胞仪显示随尼美舒利浓度升高，实验组Th1细胞阳性率升高，而Th2细胞呈下降趋势，Th1/Th2比值升高(P<0.05)，见表2，图3。

表2 尼美舒利对胆管癌细胞Th1/Th2的影响

3 讨论

随着肿瘤免疫学的发展，人们认识到肿瘤的发生、发展与荷瘤机体的免疫状态密切相关。正常的机体免疫系统，对体内肿瘤细胞有识别与清除作用，当机体免疫功能受抑制时，肿瘤细胞能以多种方式逃避免疫系统的监视，得以存活并进一步发展，而新生肿瘤又能够分泌多种因子反过来加重对机体的免疫抑制。近年来研究发现肿瘤组织多分泌Th2类细胞因子，处于Th2细胞因子优势状态，这可能是肿瘤发生免疫逃逸的机理之一，因此研究Thl/Th2细胞状态，从而为肿瘤免疫治疗提供依据，已成为当前的热点。

Yamamura等[5]首先报道肿瘤患者呈Th2类细胞因子优势表达，处于Th1/Th2偏移状态, 这种偏移可能是导致肿瘤细胞产生免疫逃逸持续增长的机制。Li等[6]采用ELISA法检测了124例非小细胞肺癌(NSCLC)患者和124例健康体检个体外周血术前术后Th1和Th2细胞因子的表达，结果发现NSCLC患者术前IL-4和IL-10浓度明显升高，而IL-2和IFN-γ浓度显著降低。同术前相比，手术后患者IL-4和IL-10浓度显著降低，而IL-2和IFN-γ浓度明显升高。术后IL-4水平异常的患者1年及3年累积复发率明显高于正常患者，且中位生存时间和生存率显著降低。近年来流行病学研究显示长期口服非甾体抗炎药可减少大肠癌的发生，大多数的动物实验和体外细胞培养研究也显示其能抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖，其机制目前多认为与其抑制环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表达有关。此外国内外研究还发现, COX-2通过催化花生四烯酸使其代谢产物PGE2增加，进一步通过EP2受体抑制树突状细胞的分化和功能,通过Th1/Th2偏移减弱细胞免疫所调节的抗肿瘤反应[7-8]，这为胆管癌的防治提供了新的分子靶点。尼美舒利是一种新型COX-2抑制剂，对多种肿瘤的生长具有抑制作用，我们前期试验也发现[9-10]，选择性COX-2抑制剂尼美舒利对体外培养胆管癌细胞QBC939的增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。为继续探讨COX-2抑制剂抗肿瘤机制，本研究继续采用选择性COX-2抑制剂尼美舒利作用于胆管癌细胞，观察其对胆管癌细胞株Th1/Th2平衡的影响。我们的实验结果显示尼美舒利抑制人胆管癌HCCC-9810细胞生长，呈明显的浓度和时间依赖性，并且随药物浓度增加、作用时间延长，细胞生长抑制率逐步增加，透射电镜下尼美舒利作用后的细胞形态发生改变，细胞表面微绒毛减少，切片中出现细胞核固缩，染色质边集，新月体形成等细胞凋亡的形态学改变。我们采用ELISA法和流式细胞仪检测不同浓度尼美舒利作用于胆管癌细胞后Th1/Th2细胞因子的表达，以进一步探讨其抑制肿瘤生长的免疫机制。我们发现，随药物浓度增加，实验组中IL-2、IFN-γ浓度呈现上升趋势，而IL-4、IL-6浓度下降， Th1/Th2比例升高，这种作用在低浓度水平时就开始出现，并随着药物浓度升高而增强，表现为明显的逆转作用，这提示我们尼美舒利可能是通过诱导胆管癌细胞表达Th1细胞而抑制Th2细胞的表达，从而逆转Th1/Th2偏移，抑制肿瘤生长。