周晓斌 刘莉 李永光 孙俊 陈寅

650111 昆明，武警云南总队医院内一科(周晓斌)，医务处(刘莉、李永光、孙俊)，病理科(陈寅)

锌指样转录因子2(Krüppel-like transcription factor 2，KLF2)隶属于Spl/Krüppel样转录因子家族，不仅在胚胎血管内皮表达，参与维持血管正常形态的发育[1]，而且具有抗炎、抗增殖、抗凝的作用。在循环系统中，KLF2是维持血管完整性的重要因子；在血管内皮细胞中，被誉为“分子开关”；在粥样硬化病变中参与多种因子的转录调控。近年相关研究提示，KLF2与冠状动脉粥样硬化密切相关[2]。我们的前期研究也发现，在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉的不稳定斑块中KLF2表达明显减少[3]。然而目前对KLF2与冠心病的关系鲜见人体研究报道。因此，本研究通过检测KLF2在冠心病患者血清中的含量，探讨人体内KLF2与冠心病及斑块稳定性的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本研究为非随机对照临床试验。入选2013—2016年武警云南总队医院和圣·约翰医院共79例住院患者，其中男性51例，女性28例，年龄25～86岁，平均(59±14)岁。将患者分为3组：不稳定斑块组45例、稳定斑块15例和对照组19例。分组标准[4]：(1)不稳定斑块组：冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄，颈动脉超声可见软斑块，近1年内发作过急性冠状动脉综合征，入院前未规律服用他汀类药物；(2)稳定斑块组：冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄，颈动脉超声可见硬斑块，近1年内未发作过急性冠状动脉综合征，入院前未规律服用他汀类药物；(3)对照组：无心血管疾病病史及家族史，颈动脉超声未见斑块，入院前未服用过他汀类药物。3组间性别、年龄构成差异无统计学意义，见表1。排除标准：(1)发病前1个月有重大外伤或手术史；(2)有严重心脏、肝脏、肾脏等器官功能衰竭；(3)患慢性炎症性或感染性疾病；(4)近期(6个月内)有非冠状动脉血栓性疾病；(5)妊娠。本研究经医院道德伦理委员会许可(医伦【2013】002号)，所有患者均签署知情同意书。

表1 患者分组情况

注：ACS：急性冠状动脉综合征；“—”代表无此项；与其他两组比较，aP>0.017

1.2 仪器与试剂

仪器：PHILIPS Envisor-HD彩色多普勒超声仪(菲利浦公司，美国)，KHB ST-360007自动多功能酶标仪(科华公司，中国)；FYL-YS-100L恒温箱(福意公司，中国)。试剂：Human KLF2 Elisa 试剂盒(华美公司，中国)。

1.3 超声检测颈动脉斑块

用高分辨率彩色多普勒超声仪观察颈动脉斑块的特征及测量各项参数。患者取平卧位，头略后仰并偏向检查对侧，充分暴露颈部，探头轻放患者颈部体表，嘱患者平静呼吸。首先对患者双侧颈总动脉分叉处进行检查。硬斑块富含纤维组织，在超声下显示为均一的高回声；软斑块由薄的纤维环包绕大的脂质池构成，多显示为低回声或不均一的混合回声。测量颈动脉斑块体积(长×宽×高)，斑块纤维帽厚度，内膜中层厚度，计算平均斑块体积=[(左侧斑块体积+右侧斑块体积)/2]，平均斑块纤维帽厚度[(左侧斑块纤维帽厚度+右侧斑块纤维帽厚度)/2]，平均内膜中层厚度=[(左侧斑块内膜中层厚度+右侧斑块内膜中层厚度)/2]，斑块稳定性=平均纤维帽厚度/平均内膜中层厚度。

1.4 ELISA法检测血清中KLF2含量

患者清晨空腹取血离心后分装冻存，将血清样本从-80℃冰箱中取出，室温下预温30 min。配制不同浓度标准品，加样，100 μl/孔，37℃恒温箱孵育2 h，倾弃每孔液体，不洗。每孔加100 μl生物素抗体(Biotin-antibody，1×)，37℃孵育1 h，洗板3次。每孔加100 μl辣根过氧化物酶抗生物素蛋白(HRP-avidin，1×)，37℃孵育1 h，洗板5次。每孔加90 μl四甲基联苯胺(TMB)呈色底物，37℃避光孵育30 min。每孔加50 μl终止液，5 min之内用酶标仪测量450 nm波长下的OD值。绘制4参数曲线，计算出样本KLF2浓度。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 不稳定斑块组患者斑块稳定性较差

通过超声测量颈动脉斑块发现，与稳定斑块组比较，不稳定斑块组斑块体积较大[(10.24±5.05)mm3比 (5.41±2.99)mm3，P<0.01]，斑块纤维帽厚度较薄[(0.86±0.19)mm 比 (1.28±0.32)mm，P<0.01]，斑块内膜中层厚度较厚[(2.79±0.19)mm 比 (1.99±0.37)mm，P<0.01]，斑块稳定性较差(0.35±0.14 比 0.66±0.17，P<0.01)，见表2。进一步ROC曲线分析显示，斑块稳定性评估(平均纤维帽厚度/平均内膜中层厚度)的截断值是0.47(P<0.01)，灵敏度和特异度分别为86.67%和80.00%。

2.2 KLF2在冠心病患者血清中的含量较低

与对照组相比，不稳定斑块组+稳定斑块组的KLF2含量明显降低[(0.88±0.75)pg/ml 比(5.04±3.07)pg/ml，P<0.01]。

2.3 KLF2在不稳定斑块患者血清中的含量较低

与对照组比较，KLF2在不稳定斑块组中的含量较低[(0.59±0.22)pg/ml比(5.04±3.07)pg/ml，P<0.01]；与稳定斑块组比较，KLF2在不稳定斑块组中的含量较低[(0.59±0.22)pg/ml 比(1.77±1.05)pg/ml，P<0.01]。

表2 超声测量颈动脉斑块结果

注：与稳定斑块组比较，aP<0.01；“—”代表无此项

2.4 血清中KLF2含量与斑块稳定性的相关性

相关分析显示，血清中KLF2的含量与斑块稳定性呈正相关，相关系数(r)=0.534(P<0.01)。

3 讨论

以往的基础研究可为KLF2在抗动脉粥样硬化中扮演的角色提供一些证据。最初发现，KLF2基因的缺失可导致或加重动脉粥样硬化病变[5]，表明KLF2在动脉粥样硬化中有重要作用。深入的研究提示，KLF2可能通过斑块中的内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞及多种机制参与动脉粥样硬化的发生与发展[2，6]。

我们前期的研究发现，在载脂蛋白E基因敲除小鼠的冠心病动物模型中，KLF2在其主动脉不稳定斑块中的表达明显减少[3]。本研究通过检测KLF2在冠心病患者血清中的含量，发现KLF2不仅在冠心病患者血清中含量较低，而且在不稳定斑块患者血清中的含量也降低；相关分析显示，KLF2与斑块稳定性呈正相关。因此，在人体较为复杂的真实环境中，KLF2仍与冠心病相关。

根据以往研究推测，一旦KLF2含量减少，可能导致组成斑块的内皮细胞受损[6]，巨噬细胞和中性粒细胞粘附并分泌炎性介质，脂肪细胞分化增加，平滑肌细胞增殖迁移，从而斑块的稳定性被削弱，心血管事件的发生率增加。

由于冠状动脉斑块稳定性的检查(如冠状动脉血管内超声)目前难以在临床普及应用，本研究采用四维入组标准(冠状动脉造影+颈动脉超声+急性冠状动脉综合征的发作+他汀的使用)来尽量提高不稳定斑块患者评估的客观性。近年来国外有研究显示，颈动脉斑块内膜中层厚度和斑块积分可很好地代表冠心病患者冠状动脉病变的程度[7]。本研究借鉴并拓展了颈动脉斑块稳定性的评估方式，测量了颈动脉斑块的体积、纤维帽厚度、内膜中层厚度，从而计算出斑块的稳定性，且以上数据采用双侧颈动脉斑块取平均值的方式，使得评估更科学。根据本研究所得数据分析，不稳定斑块组患者颈动脉内的斑块与稳定斑块组相比，具有更大的斑块体积和内膜中层厚度，以及更薄的纤维帽，因此稳定性更差。本研究显示，颈动脉超声测量平均纤维帽厚度/平均内膜中层厚度的比值如果超过0.47，则患者体内斑块易损的可能性越大。然而，本研究的分组毕竟缺乏客观的血管内影像评估，且样本量小，其客观性及代表性也受到了一定的局限。

综上，KLF2在冠心病患者血清中的含量较低，也许是冠心病的一个特征信号，KLF2与不稳定斑块的相关性可能为冠心病的治疗提供新的思路。然而，将来还需更多的研究为此提供证据。

利益冲突：无