王诗萌 李甜 杨田野

[摘要]皮肤像人类其他器官一样，随时间而衰老。但又不同于其他器官，影响皮肤衰老的一项重要的环境因素是紫外线辐射。随着大气臭氧空洞的增加、环境光污染的加重及人们生活水平的提高，大家越来越注重皮肤因光损伤导致的红斑、皱纹、色沉、弹性减弱等问题。对光老化皮肤的治疗方法则更是目前的研究热点，但因自然光老化是一个十分漫长的过程，所以有关光老化的实验大多建立在光老化实验动物模型的基础上。因此，建立一个可靠的更接近于人类皮肤自然光老化的模型具有重要意义。本文就当前光老化的发生机制、光老化模型造模方法、检测标准进展归纳总结如下。

[关键词]皮肤衰老；光老化；抗衰老；动物模型；紫外线辐射

[中图分类号]R339.3+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）07-0146-05

Abstract：Skin，like other human organs， skin anginghappens with time. But different from other organs， an important environmental factor affecting skin aging is ultraviolet radiation . With the increase of ozone hole in the atmosphere， the aggravation of environmental light pollution and the improvement of people's living standard， people pay more and more attention to the changes of skin caused by photo damage and photoaging， such as erythema， wrinkles， pigmentation and elasticity decline. Therefore， the research on the mechanism and treatment of photoaging has become a hot topic. However， natural photoaging is a long process， so most of the experiments of photoaging is a step after the establishment of the experimental animal model of photoaging. Therefore， it is important to establish a reliable model closer to the natural photoaging of human skin. This review mainly summarizedthe mechanism of photoaging， the modeling methods of photoaging， and the progress of detection standard.

key words： skin aging； photoaging； anti-aging； animal model； UV radiation

皮膚是人体最大的器官，并作为人体的第一道防线，保护着人体免受外界理化因素及微生物的侵袭。但与此同时，它也是最容易受外界环境影响的器官，其中紫外线、寒冷、风吹及化学暴露均可导致皮肤受损及老化，而紫外线是诱发人类皮肤光老化所有因素中最重要的一个[1-2]。光老化的外观特点是皮肤粗糙，皱纹加深并伴有色素沉着，病理特点是表皮角化不良伴异常增生，真皮变薄、胶原减少、弹性纤维降解等[3]。而紫外线在诱导光老化的同时，也可以引起多种皮肤病变，甚至是皮肤恶性肿瘤。所以光老化在当代已经以一种疾病及综合征的姿态而成为研究热点[4-5]。现今对于抗光老化的治疗研究中，由于存在伦理限制及不便因素，研究者们常常先建立起实验动物光老化模型后，再进行下一步治疗研究。但由于光老化发生机制复杂、临床表现多样，如何建立起更具有代表性及更贴近于人类光老化皮肤的模型，尚缺乏一定评价标准。本文通过对光老化的发生机制、目前国内外常用的光老化实验动物及照射光源的选择进行一定归纳，并最后总结出评价光老化的研究指标，以期为进行实验的研究者提供参考。

1 光老化的发生机制

太阳发射多种色谱光源，波长各不相同并相互作用，包括紫外线（ultraviolet， UV）、可见光和红外线（Infrared Radiation，IR）。光老化的发生机制不仅复杂又相互作用，其主要机制及学说有：细胞基质异常降解、自由基及线粒体突变学说、免疫抑制及炎症浸润等[6]。从分子机制讲，UV辐射可以使大量的活性氧自由基（ROS）得到累积，一方面ROS可以使端粒缩短，另一方面又可以损伤核DNA，同时又可活化细胞表面受体，诱导核转录复合物活性蛋白（activator，protein，AP-1）活化，而AP-1的主要作用就是抑制胶原蛋白合成、促进胶原蛋白分解，同时又参与免疫调节，促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的转录（MMP是一种胶原酶，可促进胶原降解）；而AP-1不仅会阻止转化生长因子（TGF-β）转录及还会降低TGF-β受体水平，从而抑制胶原合成[7-8]。

自然光中的紫外线按照不同的波段，又分为UVA（ultraviolet， UVA）、UVB（ultraviolet， UVB）、UVC（ultraviolet， UVC）。由于UVC在穿过地球时会被臭氧吸收，所以紫外线所引起的皮肤光老化基本可以看作是UVA及UVB的作用。简单地说，UVA通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信号传导通路，促进 MMPs表达生成，抑制胶原的合成[9-10]。而UVB则通过抑制机体免疫系统，促进MMPs表达生成，抑制胶原的合成[2，11]。日光中红外线和热量可以诱导皮肤新生血管的生成[12]。CHO[13]曾经通过研究证实，IR和热能够诱导皮肤新生血管和炎症性细胞浸润，再通过MMPs破坏真皮的细胞外基质，改变皮肤的结构蛋白，从而加速皮肤的光衰老表现。

2 光老化的分型

光老化的临床表现复杂多样且程度不同，进行光老化的分型研究有助于我们在光老化的模型研究中进行分类描述。现今仍然沿用的是Glogau分型，它是通过对患者的不同临床表现程度及情况进行光老化分型[10]，见表1。

3 光老化与自然老化的区别

自然情况下，随着人类年龄的增长及外出活动的影响，在光老化和自然老化同时相叠加的作用，形成了人类老年时的皮肤临床表现。然而，自然老化与光老化，因其机制不同，而形成不同的区别表现。了解这些区别有助于我们建立更贴近于人类皮肤衰老的模型。刘玮等[14]曾经根据年龄、原因、影响因素、范围、临床及组织学特征、并发肿瘤等方面对皮肤光老化和皮肤自然老化进行区别，见表2。

4 光老化模型实验动物的选择

在模型动物选择方面，可以选择啮齿类的实验鼠和及小型猪。但因为小型猪具有难饲养，价格高以及难以操作等缺点，所以国内外大多学者选用更易于操作和饲养的实验鼠作为光老化模型动物。20世纪80年代，国外研究者使用Skh-1（hr/hr）无毛小鼠，成功地模拟出了光老化的皮肤[15]，并且认为该小鼠的皮肤组织学改变十分贴近人类皮肤光老化改变[16]。SKH-1无毛小鼠由Charles Rive从斯坦福大学引进，它因具有稳定无毛基因，是国外常用的皮肤病、皮肤肿瘤及皮肤光老化损伤的动物模型，但因价格昂贵限制了其在国内的应用。2015年，Jeong[17]首次使用裸鼠（nu/nu）作为光老化模型实验动物，并发现因为裸鼠的修复能力较强，所以其最小红斑计量（MED）比无毛老鼠更大，需要更频繁的照射。裸鼠因同样具有无毛特征、无胸腺缺乏细胞免疫，因而更适合进行光老化模型后的人细胞治疗实验，而成为研究学者探讨后续干细胞治疗的热门动物。但因裸鼠的饲养及环境需要较高的清洁等级，限制了其国内应用。由于各种因素，国内学者常常选择使用人工脱毛后的SD大鼠作为光老化模型动物[4-5，18]。然而在自然状态下，SD大鼠因喜夜间活动所以并不会受到紫外线的照射而产生光老化皮肤改变，同时反复多次人工脱毛会给皮肤带来一定的刺激，影响实验结果，所以SD大鼠并不适合作光老化模型动物[19]。

5 造模的紫外线光源选择

从上述光老化的发生机制中可以看出，UVA及UVB是引起光老化发生的主要影响因素。UVA是指波长315～400nm的紫外线，穿透能力较强，可穿透表皮至皮肤基底层和真皮层，是皮肤变黑的主要元凶；UVB是指波长280～320nm的紫外线，易被表皮所吸收，主要引起皮肤红斑、皮肤皱纹粗糙加深[2]。根据不同的实验需求及实验室环境，研究人员选择的辐照光源往往不同。由于老鼠的皮膚常常较人皮肤薄，所以有许多学者选择用穿透能力不是那么强的UVB作为光源。但在自然日光中UVA的剂量是UVB的500～1 000倍，所以也有许多学者选择用UVA+UVB光源同时照射来模仿自然状态下的光照[4，20]。

6 造模过程中的注意事项

6.1 紫外线的危害：紫外线照射具有杀菌作用，可以影响和调节人体呼吸、循环及免疫系统等，但过量的紫外线照射，会危害人体健康，甚至会引起电光性眼炎及白内障[21]。Podskochy等[22]采用波长310nm的紫外线照射兔眼角膜76h后，兔眼的角膜出现细胞损伤、水肿、混浊的改变。所以在造模的过程中，实验员及实验动物都应该进行一定的保护措施，以避免紫外线给实验动物带来除光老化的其他副损伤，而影响实验结果。

6.2 最小红斑剂量的确定：最小红斑量（Minimal erythema dose， MED）是指在一定光源或特定波段光线照射下所引起的照射部位在24h后仍可察觉红斑的最小照射剂量[23]，通常由两名以上有丰富经验的观察者所判定。基本在所有文献中，研究员均以MED为起始照射剂量，并以周为单位逐渐递增照射剂量。然而在不同的文章中，即使是同一种实验动物，其最MED、照射频率却不尽相同。虽然MED的定义明确，但实际MED的值却较难判断，给实验带来了一定的困难。所以在进行实验之前，一定要进行预实验判断MED，摸索照射剂量，才能最大地减小影响实验结果的因素。

7 检测标准的选择

光老化模型是一个影响因素多、耗时长、检测指标复杂的模型。虽然光老化的实验模型研究数量较多，但对于光老化模型成功的检测方法常常见仁见智。笔者通过阅读大量文献，归纳出光老化的评价指标大多集中在大体肉眼观察、三维扫描或皱褶复制品分析法、病理切片及特殊染色的镜下观察、免疫组化定量分析。具体检查指标，见表3。

从表3可以看出，I型胶原蛋白的检测至关重要，这从光老化的发生机制可推断出，老化的外观改变主要是由于皮肤胶原的成分及性状改变。人类皮肤中的胶原主要由I型和Ⅲ型胶原组成，I型胶原占85%，既可以维持皮肤饱满充盈又可以承受拉力；而Ⅲ型胶原是幼稚胶原，胶原纤维较细；日光的照射影响了Ⅰ型胶原的合成，改变了Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例，从而导致了皮肤松弛、弹性降低、皱纹加深的临床表现[25]。所以，在验证光老化模型是否成功时，应有一定的对于皮肤胶原检测的实验结果。但值得注意的是，影响皮肤胶原蛋白含量的因素不仅只有紫外线。因此，仅有胶原含量的检测并不能代表光老化模型成功，还应该结合光老化发生机制对组织中进行AP-1、MMP、SOD，甚至是细胞中ROS的检测。

8 小结与展望

综上所述，光老化模型实验影响因素较多、成本较高、耗时较长。选择不同的实验动物、MED、照射频率、紫外线光源等均可较大地影响到光老化模型的检测指标。笔者通过阅读国内外文献发现裸鼠因其具有以下优势，成为学者们常用的光老化实验动物：①裸体无毛，免除了脱毛给皮肤带来刺激和损伤，减少了实验影响因素；②光老化裸鼠的皮肤与人皮肤老化改变相似[19]。但是裸鼠本身皮肤松弛，幼年裸鼠皮肤便有大量褶皱，这对模拟人类正常老化中的皱纹具有一定影响，加之其表皮十分菲薄，较低的照射剂量即可造成皮肤损伤，出现表皮破损、出血，如此反复还会生成瘢痕。而一旦形成瘢痕，则会因瘢痕存在的大量胶原组织而影响最终胶原的检测，从而导致实验失败。所以，把握准确的MED及照射剂量是实验关键。笔者认为MED不仅与动物本身的种类、年龄、皮肤薄厚程度不同而不同，还与实验室本身的环境有关。所以，如果使用裸鼠作光老化动物模型，一定要开展本实验室的模拟预实验，切不可参照其他文献照射剂量而盲目开始照射。

光老化造模的时间相对较长，根据不同动物皮肤厚度不同，照射剂量亦不同。但无疑过长的紫外线照射会致动物眼睛损伤，一旦损伤则会给实验带来干扰因素，影响实验结果。所以，为了确保照射剂量较准确，照射部位精准，照射时固定实验动物是一个不错的选择。麻醉虽然操作简单，但难以控制麻醉剂量，易致死，而且光老化照射次数多，反复麻醉不推荐使用。如果可以就不同的实验动物进行头部及重要部位的遮挡及四肢固定，这样既可以进行自身照射后效果对比，又可以简易地判断MED，是较为理想的照射方法。

未来，随着人类科技的不断进步，求美者的不断增多，治疗光老化皮肤的方法将多种多样。现已有多篇文章证明了脂肪干细胞、间充质干细胞、维甲酸、点阵激光等均具有治疗皮肤光老化的作用[17，26-28]。鉴于这一特点，未来光老化老模型必定会在对抗衰治疗的探索中不断完善，更加与人类衰老皮肤相似。

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[收稿日期]2018-05-07 [修回日期]2018-06-22

编辑/李阳利