张佳悦,陈俊宇,赵本正,吴 珊,刘 剑*,孙连平*

(1.延边大学医学院，吉林 延吉133000；2.吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，atrazine，ATR)是全球范围广泛使用的广谱除草剂之一，目前，杀虫剂和除草剂已成为农业系统中不可分割的一部分。据美国环保局数据统计，在北美的一些河流中，ATR的浓度高达108 μg/L。在中国，太湖和辽东河水中的ATR浓度也远远超过了3 μg/L的饮用水标准，在辽东河，ATR的浓度甚至达到18.93 μg/L[1,2]。在接触ATR的农民的血液和尿液中己经检测到了ATR污染[3]。

在墨西哥哈利斯科州Nextipac社区发现接触ATR的工人存在器官和细胞水平的异常[4]。美国肯塔基州公共饮用水中的ATR也增加了当地孕妇早产比率[5]。大量的研究发现，ATR具有神经系统、免疫系统、内分泌系统、生殖系统等多系统毒性、氧化应激损伤及肿瘤促发作用[6]，ATR的危害已经引起学者们广泛的重视。

大量报道中提到ATR可以诱导脂质过氧化反应[7-9]。活性氧生产增多可以导致DNA单或双链的断裂[10]，最近，在各种动物体内进行了关于ATR诱导的氧化损伤的研究，如小鼠、蚯蚓、鱼等[10-14]。Singh[12]等人研究表明，在雄性Wistar小鼠体内ATR可以诱导氧化应激，增强脂质过氧化和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)的活性。Jin等人[13]研究了成年雌性斑马鱼接触ATR后在过氧化压力下的反应，结果显示在肝脏中，SOD和CAT活性增高。Bhatti JS等[15]证实了ATR在小鼠红细胞中提高丙二醛(MDA)水平，提高CAT、SOD、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。

本实验通过给小鼠不同剂量的ATR连续灌胃，观察小鼠肝脏组织的活性氧水平和Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的含量，其目的是确定ATR对小鼠肝脏的氧化损伤，分析肝脏在氧化损伤下的保护机制。

1 资料与方法

1.1动物分组及处理

4周龄雌性C57B l/6小鼠购于吉林大学基础医学院实验动物中心，32只随机分4组。以等体积玉米油为对照，阿特拉津分别选择5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR[16]。小鼠以恒定温度、恒定湿度饲养于该中心，小鼠连续28天每日上午灌胃，第29天麻醉下腹主动脉取血处死，取新鲜肝脏组织。

1.2主要试剂及仪器

阿特拉津为美国Sigma Aldrich产品，纯度99%，玉米油溶解。CAT检测试剂盒为南京建成公司产品。兔抗Nrf2、Keap1、NQO1、HO1单克隆抗体为Proteintech Group公司(美国)产品。羊抗兔IgG(二抗)和ECL试剂盒购自美国promega公司。其余试剂为美国Sigma公司产品。凝胶成像系统(2500R)为中国Tanon生产，电泳仪(AE-8800)为美国Bio-rad生产，分光光度计(VIS-7220)为北京第二光学仪器厂产品。

1.3检测CAT、GSH活力和NO、MDA含量

冰上研磨制备10%肝脏组织匀浆，测定蛋白浓度(bradford法)，-20℃保存备用。依照试剂盒说明书检测肝脏组织的CAT、GSH活性及NO、MDA含量。

1.4Westernblot方法检测Nrf2、NQO1、Keap1、HO1蛋白表达

加入液氮的同时研磨肝脏组织，冰浴条件下裂解蛋白，离心取上清，定量后取30 μg，加入缓冲液，99℃水浴，恒压SDS-PAGE电泳(75 V 30 min，120 V 60 min)，转膜(100 V，1 h)，牛奶封闭，TBST洗膜，封闭一抗、二抗，ECL发光显色。GIS 凝胶成像分析系统分析光密度值，分别计算Nrf2、NQO1、Keap1、HO1的相对光密度(A)值(内参β-actin)。

1.5统计学分析

2 结果

2.1NO、MDA含量增高

本实验以生化检测分析ATR作用下肝脏组织匀浆的活性氧水平，结果如表1显示：浓度为25 mg/kg和125 mg/kg的ATR提高肝脏组织匀浆中NO含量，浓度125 mg/kg的ATR提高MDA含量(与对照组相比，P<0.05)，提示ATR诱导小鼠肝脏组织活性氧水平增高。

表1 肝脏组织内MDA及NO含量

*：与0 mg/kg组相比，P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表达变化

本实验进一步通过western blot法分析小鼠肝脏组织中Nrf2和Keap1的蛋白含量，分析了ATR持续作用下小鼠肝脏中Nrf2的激活情况。结果如图1，中、高ATR剂量组(25 mg/kg和125 mg/kg)相对于0 mg/kg剂量组，Nrf2的表达明显增高(P<0.01)，Keap1的蛋白含量逐渐降低，甚至低于对照组(P<0.05)。

*：与0 mg/kg组相比，P<0.05；**：与0 mg/kg组相比，P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表达增高

为了进一步分析Nrf2通路激活后肝脏组织中Ⅱ相解毒酶的变化，本实验通过Western blot法检测HO1和NQO1的含量。结果显示：相对于对照组，浓度为5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR促使HO1和NQO1的表达上调(P<0.01)，见图2。

**：与0 mg/kg组相比，P<0.01

2.4CAT和GSH的活力变化

为了分析Nrf2通路激活后肝脏中抗氧化酶的变化，本实验检测CAT和GSH的活力。结果显示：与5 mg/kg组相比，浓度为25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力减弱(P<0.05)；浓度为5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力减弱(P<0.05)，见表2。

3 讨论

ATR及其代谢产物于地表水、地下水中经常可以检测到[17]，在家中同样可以检测到ATR，并且可以追踪到泥土[18]。在ATR暴露人群的尿液中已经检测出ATR的代谢物[19]。考虑到ATR的生物蓄积作用，ATR的损害应引起足够的重视。最近，在各种动物体内进行了关于ATR诱导的氧化损伤的研究，如小鼠、蚯蚓、鱼等[10-14]。本实验通过给小鼠连续灌胃28天，以等体积的玉米油为对照，实验组给以浓度为5 mg/kg、25 mg/kg以及125 mg/kg的ATR，第29天腹主动脉取血处死小鼠，观察小鼠肝脏组织的活性氧水平和Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的含量。

表2 肝脏组织内CAT的活力

*：与0 mg/kg组相比，P<0.05；**：与0 mg/kg组相比，P<0.01

当自由基生成和来自防御系统的降解失衡时会导致自由基的积累，活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)过高就是自由基积累的典型[20]。当ROS产生过多时可以与各种分子如脂类、碳水化合物、蛋白质和DNA反应，从而改变了它们的结构和功能，产生细胞损伤，导致病理过程，包括动脉粥样硬化、癌症、关节炎等潜在的有害反应[1]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)是脂质过氧化反应中过氧自由基(ROO·)重排环化后形成的过氧化作用的最终产物[15]。为印证ATR对小鼠肝脏的氧化损伤，本实验分析了ATR作用下肝脏组织匀浆的活性氧水平，发现：与对照组相比，ATR上调MDA和NO水平，说明ATR诱导肝脏组织匀浆的活性氧水平提高。

在氧化应激状态下，至关重要的信号通路如Kelch-like ECH-associated protein (Keap1)/NF-E2-related factor 2 (Nrf2)信号通路是针对氧化损伤产生的早期保护性机制[15]。生理状态下，Nrf2与Keap1结合，将Nrf2固定于胞浆，Nrf2活性被抑制[21]，修改重塑Keap1的半胱氨酸残基，如氧化和S-亚硝基化，导致Nrf2易位到细胞核[6]后，刺激编码解毒酶和抗氧化酶的基因转录，以消除活性氧，保护细胞[22]。

因此在发现ATR作用后肝脏组织活性氧水平增高后，我们进一步分析Keap1/Nrf2信号通路的表达情况，发现ATR处理后Nrf2的表达增高，Keap1的蛋白含量低于对照组。分析原因可能是由于ATR诱导肝脏组织中氧自由基生成过多，促使肝脏组织在ATR的氧化压力下发生适应性反应，刺激Nrf2表达上调，Keap1的表达下调，使更多的Nrf2解离进入细胞核，进一步激活Nrf2信号通路。

Nrf2进行信号转导，与抗氧化反应元件(antioxidative reactive element，ARE)结合[15]，启动ARE下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的转录[15]。血红素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1)和苯醌氧化还原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl)是主要的抗氧化酶之一，用于清除过氧化氢[22]。

本实验中，在ATR的作用下，HO1和NQO1蛋白含量上调。较高剂量的ATR将会超出肝脏组织的抗氧化系统的容忍力，机体抵抗氧化损伤的能力与抗氧化酶的水平和类型相关[23]。本实验中，浓度为25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力减弱，浓度为5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力减弱。在一般情况下，活性氧生成增加时，CAT和GSH含量增高，将过氧化氢分解为水和氧分子[23]，分析可能是ATR所引起的H2O2产生增多，使CAT和GSH消耗高于其他抗氧化酶。相对较高的ATR接触剂量下，ATR诱导的氧化损伤的压力超出了肝脏抗氧化酶的耐受能力[24]，当然，在相对较高剂量的ATR作用下，肝脏的Ⅱ相解毒酶HO1和NQO1蛋白含量仍是增高的，说明此时肝脏主要依靠Ⅱ相解毒酶的作用抵抗氧化损伤。

综上，ATR可以诱导小鼠肝脏氧化应激作用，肝脏组织反应性提高了Nrf2的表达，通过Keap1/Nrf2/ARE通路上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达。在ATR中剂量组和高剂量组，ATR诱导的氧化损伤的压力超出了肝脏抗氧化酶的耐受能力，CAT活力减弱，印证了ATR对肝脏的氧化损伤作用。本实验通过分析ATR作用下肝脏活性氧水平和Nrf2信号传导通路的表达情况，探讨了ATR暴露对肝脏的氧化损伤，有助于进一步探索ATR对肝脏的损伤机制。

4 结论

ATR可以诱导小鼠肝脏氧自由基生成增多，肝脏组织激活Nrf2信号通路，上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达。当ATR浓度增高，氧化损伤的压力超出了肝脏抗氧化酶的耐受能力，CAT和GSH活力减弱，印证了ATR对肝脏的氧化损伤作用。